二穗短柄草(Bra chyp odium dista chyon)从属于禾本科早熟禾亚科短柄草属,全基因组测序已经完成。二穗短柄草具有理想模式植物必备的许多优点,而且存在广泛的环境适应性和遗传多样性。尤其是二穗短柄草与温带谷类作物及饲草的系统进化关系比水稻与温带谷类作物及饲草的系统进化关系更加接近。目前二穗短柄草已经作为早熟禾亚科植物农艺性状研究的模式植物被广泛利用。但是关于二穗短柄草的抗寒冻分子机理研究还未见报道,二穗短柄草和核心早熟禾亚科植物(包括小麦族和牧草族)抗寒冻机理的异同值得探讨。为此本研究以4种不同基因型二穗短柄草(BD21、BD3-1、BD29-1、BD1-1)、多年生黑麦草(Lp)和梯牧草(Pp)为主要研究材料,通过不同时间冷驯化处理样本的实时定量荧光PCR技术、基因芯片杂交技术和利用噬菌体文库筛选与抗寒冻相关目的基因技术等实验方法研究了3类与早熟禾亚科抗寒冻相关基因家族的在冷驯化处理后的不同表达模式。这3类早熟禾亚科抗寒冻相关基因家族分别是抑制冰晶再结晶基因家族,the ice recrystallization inhibition proteins genes (IRIps);果糖基转移酶基因家族,thefructosyltransferase genes (FSTs);C-序列重复转录因子基因家族,the C-repeat binding factor genes (CBFs)。实验还测定了总碳水化合物及果糖在冷驯化处理前后的表达差异以及不同链长果聚糖组成成分差异。探索了利用农杆菌侵染方法转化二穗短柄草主要抗寒冻相关基因的转基因技术。最后对二穗短柄草作为早熟禾亚科研究模式植物,尤其是在早熟禾亚科植物抗寒冻研究方面的可靠性作出了综合评估。所获得的主要研究结果如下：1.抑制冰晶再结晶基因家族IRIps能够在细胞受到寒冷胁迫时,阻止原生质体膜间已形成冰晶的进一步扩大,从而减少低温胁迫对细胞的伤害。早熟禾亚科的共同原始IRIps基因是由亮氨酸重复蛋白激酶LRR-protein kinase通过获得多拷贝的冰晶结合元件(NxVxG/NxVxxG)进化而来的。在核心早熟禾亚科植物中,多次的基因序列重组和复制导致了IRIps基因家族中有大量成员存在。通过与多年生黑麦草中的LPIRIps序列比对得知,二穗短柄草BD21标准株系中存在7个抑制冰晶再结晶基因家族成员,都位于第五染色体上。且分为正反方向分布的两个基因簇。2.早熟禾亚科中抑制冰晶再结晶同源基因的进化关系图谱分析表明二穗短柄草中抑制冰晶再结晶基因与小麦、大麦、南极发草以及多年生黑麦草中抑制冰晶再结晶基因有着共同的祖先。并且二穗短柄草中抑制冰晶再结晶同源基因经过多次重组突变而来。缺失了冰晶结合元件NxVxG/NxVxxG的Bradi5g22870.1和Bradi5g22880.1基因分别是从Bradi5g27350.1和Bradi5g27340.1基因缺失突变进化而来的。3.实时荧光定量PCR检测结果表明二穗短柄草中抑制冰晶再结晶基因的表达水平在冷驯化处理后表现为上调表达,且在冷驯化处理1d后达到最高峰,然后缓慢降低,在冷驯化处理10d后表达水平几乎降到处理前的表达水平。从而推定二穗短柄草中的抑制冰晶再结晶基因在二穗短柄草遭受寒冷初期有着较明显的作用。而且具体的基因还有着它自身特异的表达特色。尤其值得注意的是Bradi5g27300.1基因比较特殊,它在所有基因型中的表达量都非常低,受寒冷处理的诱导作用也很低。另外不同二穗短柄草基因型对抑制冰晶再结晶基因的表达有着较大的影响。尤其是春季型BD3-1中所检测的4个BDIRIps的表达水平都较低。这是由于春季型BD3-1的生命周期较短,控制开花的基因表达水平一直比较高,而控制开花基因抑制了与寒冷胁迫相关基因IRIps的表达。4.C-重复序列转录因子基因家族CBFs是一类可以在植物受到干旱和寒冷胁迫条件下15min之内迅速大量表达的多种目的基因的转录因子调控子。根据CBFs基因序列和功能的特异性不同,CBFs基因可以分为多个亚族。早熟禾亚科植物中CBF3和CBF4两个CBFs亚家族在植物抗寒冻方面起着最主要的作用。基因芯片研究证实BD21基因型中存在11个C-重复序列转录因子基因家族成员。而且在寒冷处理1d内有2个基因的表达量增加了2倍多。其余基因都是下调表达的。这也反应了CBFs家族基因在植物抗寒作用上的复杂功能。5.利用噬菌体文库筛选二穗短柄草BD3-1基因型中与抗寒冻相关的CBFs基因家族实验结果表明二穗短柄草中BD3-1基因型中只含有CBF3亚家族,而缺少CBF4亚家族。已有2个分别含有4个和3个CBF基因的克隆序号已经在NCBI网站上得以公布。进一步的CBFs同源基因的进化系统图表明由基因芯片技术检测到的11个CBF同源基因中只有一个基因Bradi4g35630.1归属于CBF3c亚族,其余10个基因都与多年生黑麦草的CBF3d的进化关系最近。6.果糖基转移酶FSTs能在植物能量缺乏的情况下,迅速把蔗糖分子转化成果糖得以维持生命体。低温胁迫可以诱导早熟禾亚科植物体内FSTs基因及时表达,迅速地在细胞内积累果糖分子增加参透压,从而有效地避免细胞受冷冻时失水造成的细胞损害。基因芯片检测到2个果糖基转移酶相似序列,在寒冷处理后都是上调表达的。但进一步的果糖基转移酶和反转录酶同源基因的进化系统图结果表明这2个果糖基转移酶相似序列不属于果糖基转移酶基因家族,应归属于反转录酶基因家族。7.二穗短柄草和多年生黑麦草及梯牧草的碳水化合物在冷驯化处理4d后都大大增加,但是二穗短柄草的果糖水平却变化不大。这更加证实了二穗短柄草中缺失了果糖基转移酶,果糖不是二穗短柄草抗寒冻中起主要作用的细胞物质形式。高效负离子交换色谱技术证明了多年生黑麦草中起抗寒作用的果糖是以低聚合的蔗果三糖和蔗果四糖的寡聚果聚糖起作用的。8.通过3类不同基因家族的对比分析,综合评价了二穗短柄草作为早熟禾亚科抗寒冻研究模式植物的适用性与局限性：虽然二穗短柄草由于缺失FSTs和CBF4基因受到限制,但是BDIRIps和BDCBF3基因家族的表达模式与核心早熟禾亚科植物非常相近,具有较强的指导意义。9.二穗短柄草转基因研究是利用分别带有目的miRNA载体和过表达载体的农杆菌侵染转化由基因型BD21未成熟胚诱导所产生的胚性愈伤组织,之后通过抗生素和报告荧光蛋白GFP筛选而完成的。荧光共聚焦显微镜下检测到了带有绿色荧光的转化愈伤组织,但是在转基因植株再生步骤却未能得到绿色幼芽,仅有少量白化苗分化。推测基因型BD21胚性愈伤组织的再生能力是整个BD21转基因实验未能最终成功的主要限制因素。