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拟穴青蟹(Scylla paramamosain，简称青蟹)是我国东南沿海重要的经济蟹类养殖品种，具有较高的经济价值，但其养殖过程中易受到微生物感染而降低其存活率。抗菌肽是生物体先天性免疫的重要组成部分，对外源病原体产生防御作用。因此，获得高抗性抗菌肽对于水产养殖过程中微生物病害的防治具有重要意义。自1958年Hirsch等人通过研究证实了组蛋白的抗菌功能以来，组蛋白H2A的抗菌功能被广泛关注。本研究在前期获得拟穴青蟹Histone2A合成肽Sphistin（由38个氨基酸组成）的基础上，对于抗菌肽Sphistin的高抗性功能域进行了探索，获得了具有高抗性的Sphistin[12-38]，并对其抗菌活性、抗菌机制、调控机制以及对细菌感染后机体的免疫保护作用等进行了深入研究，具体成果如下: 1.获得了抗菌肽Sphistin活性高的抗菌结构域。根据抗菌肽Sphistin蛋白二级结构预测结果，对Sphistin进行蛋白分段，通过化学合成获得多段分段肽。对于各分段肽进行抗菌活性检测，证明分段肽Sphistin[12-38]与抗菌肽Sphistin相比具有更高抗菌活性，且抗菌谱更广，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、溶壁微球菌（Micrococcuslysodeikticus fleming）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)等细菌具有很好的抑杀作用，MIC低于3μM。杀菌动力学曲线表明，短肽Sphistin[12-38]对温和气单胞菌的杀菌指数可在6h内达到100％。 2.阐明了Sphistin[12-38]的抗菌机制。大肠杆菌MC1061破膜实验结果显示，Sphistin[12-38]浓度高于25μM后能够引起细菌细胞膜通透性发生改变。DNA结合实验结果表明，Sphistin[12-38]浓度高于12μM后能够与大肠杆菌的基因组DNA结合。用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察经过FITC荧光标记的Sphistin[12-38]与温和气单胞菌互作后的定位情况，结果发现荧光信号集中于细菌胞内，证明Sphistin[12-38]能够进入细菌胞质内抗菌。 3.证明了Sphistin[12-38]作为外源蛋白的安全性。使用子宫颈癌细胞Hela和青蟹血绌胞检测Sphistin[12-38]的细胞毒性，结果表明Sphistin[12-38]浓度在0-100μg/mL范围内对正常青蟹血细胞没有明显细胞毒性，但无明显的抗肿瘤作用。通过显微镜观察发现，Sphistin[12-38]浓度在0-100μg/mL范围内与两种细胞共孵24h后并不会引起细胞形态的改变。另外，将Sphistin[12-38]注射海水青鳉后不会引起海水青鳉机体的免疫反应，证明Sphistin[12-38]作为外源蛋白是安全的。 4.证明了Sphistin[12-38]可以提高海水青鳉存活率。将Sphistin[12-38]与温和气单胞菌混合后共注射海水青鳉，与单独注射温和气单胞菌的海水青鳉相比，在注射后7天内，注射Sphistin[12-38]的海水青鳉存活率有明显提高，证明Sphistin[12-38]可以在温和气单胞菌感染时提高海水青鲻存活率。 5.发现Sphistin[12-38]能够具有缓解细菌引起的炎症反应。将Sphistin[12-38]与温和气单胞菌混合后共注射海水青鳉，在注射后48h内，海水青鳉肝脏内免疫基因表达量相对于健康的海水青鳉有明显上调;相对于单独注射温和气单胞菌的海水青鳉则有显著下调(P＜0.05)，表明Sphistin[12-38]对温和气单胞菌感染海水青鳉引起的炎症反应具有缓解作用。 6.获得了具有较好抗菌活性的联合肽Scygonadin-Sphistin[12-38]真核表达产物。利用pPIC9K真核表达载体，构建了联合肽Scygonadin-Sphistin[12-38]和Scygonadin-linker-Sphistin[12-38]重组表达载体，使用毕赤酵母真核表达体系对联合肽进行表达。获得了联合肽 Scygonadin-Sphistin[12-38]和S cygonadin-linker-Sphistin[12-38]真核表达产物，对表达产物进行抗菌活性检测，结果表明联合肽Scygonadin-Sphistin[12-38]具有较好的抗菌活性。 7.探索了抗菌肽Sphistin上游调控区重要转录调控区域。通过对已获得的青蟹Histone2A的上游调控区进行分析预测，将调控区序列分段构建重组质粒，利用双荧光素酶报告系统及鲤鱼上皮瘤细胞(endothelial progenitor cells，EPC)对分段后的调控区序列活性进行检测。结果表明，删除-860bp至-756bp和-546bp至-291bp区域启动子活性明显下降，该区域内可能含有激活基因转录的重要调控位点，而删除-756bp至-720bp区域后启动子活性显著回升，推测内可能含有抑制基因转录的负向调控位点。为深入研究抗菌肽Sphistin转录调控机制奠定了基础。