目的:肿瘤和糖尿病已成为当今严重危害人类健康和生命的重大疾病,它们的发病率和死亡率逐年升高。近年来,越来越多的临床和流行病学资料显示,糖尿病人易患结直肠癌。糖尿病患者与非糖尿病患者比较,患结直肠癌的风险明显增加,已有人提出糖尿病是结直肠癌患病的独立危险因素。糖尿病患者结直肠癌的发病率明显高于非糖尿病患者,糖尿病人群中结直肠癌的复发率和死亡率亦明显增加。糖尿病与结直肠癌的关系已经成为备受人们关注的热点;研究和揭示两者之间的病理生理关系及其分子机制,已成为该领域中迫切需要进行探索的重要课题。肿瘤免疫学的研究已经揭示,肿瘤的发生、发展,不仅与机体的免疫功能密切相关,在某种意义上更与肿瘤细胞的免疫抑制作用密切相关。肿瘤细胞分泌免疫抑制物质抑制机体免疫功能,即肿瘤细胞的免疫抑制作用,是肿瘤细胞逃避机体免疫监视,使肿瘤得以发生和发展的重要机制,在促进机体肿瘤的发生、发展中具有极其重要的作用。肿瘤细胞通过其分泌的免疫抑制物质,不但有可能在远离肿瘤部位的机体其他部位发挥免疫抑制作用,更可在肿瘤局部形成深度免疫抑制区,即所谓“黑洞”区,以至于不仅使原本就在此区之中的原位免疫细胞功能严重受抑,而且还能使由此区之外进入其中的功能正常甚至已经活化的免疫细胞成为功能受抑的“沉默”细胞,从而使之失去有效清除肿瘤细胞的能力,显然这是在即使免疫功能完全正常的机体中肿瘤也能逃避机体免疫监视而得以发生和发展的重要机制。糖尿病重要的病理生理特征之一,就是患者血中葡萄糖和胰岛素水平的异常改变。现代医学也正是依据患者血中葡萄糖和胰岛素水平的异常改变,将糖尿病的自然病程分为四个阶段。糖尿病自然病程不同阶段血中的葡萄糖和胰岛素,各有与其所处病程阶段相应的不同浓度。糖尿病患者易患结直肠癌,是否与其自然病程不同阶段血中不同浓度的葡萄糖和胰岛素能影响结直肠癌肿瘤细胞分泌免疫抑制物质有关,目前国内外尚未见报道,十分需要对之进行研究和探讨。迄今,已见于报道能由肿瘤细胞分泌的免疫抑制物质多达20余种。其中,转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-6(IL-6),是见诸报道较多、免疫抑制作用较强,并且也恰是可由结直肠癌肿瘤细胞株Colon26肿瘤细胞分泌的三种重要的免疫抑制物质。因此,本研究选用小鼠结直肠癌肿瘤细胞株Colon26肿瘤细胞作为研究对象,以模拟糖尿病自然病程血中不同浓度的葡萄糖和胰岛素对之进行作用,测定是否对Colon26肿瘤细胞分泌这三种免疫抑制物质有影响和有何影响,并初步探索是通过何种分子机制导致了这种影响。从影响结直肠癌肿瘤细胞分泌免疫抑制物质的角度,为研究糖尿病与结直肠癌之间的病理生理关系,揭示糖尿病患者为何易患结直肠癌,提供新的研究思路和实验依据。方法:体外常规培养Colon26肿瘤细胞。根据培养液(RPMI1640完全培养基, CM)中外加葡萄糖和胰岛素的终浓度不同,分为12个组:A组(对照组, Control),CM;B组(常糖组,nG),5mmol /L葡萄糖;C组(中糖组,mG),10mmol /L葡萄糖;D组(高糖组,hG),25mmol /L葡萄糖;E组(常胰岛素组,nI),5μIU/mL胰岛素;F组(中胰岛素组,mI),25μIU/mL胰岛素;G组(高胰岛素组,hI),125μIU/mL胰岛素;H组(常糖常胰岛素组,nGnI),5mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰岛素;K组(常糖高胰岛素组,nGhI),5mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰岛素;L组(高糖高胰岛素组,hGhI),25mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰岛素;M组(高糖常胰岛素组,hGnI),25mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰岛素;N组(高糖低胰岛素组,hGloI),25mmol/L葡萄糖和1.25μIU/mL胰岛素。每组均设3个复孔,置37℃5 %CO2饱和湿度的培养箱培养48小时。培养结束后,分别收集细胞培养上清和细胞。ELISA法分别检测细胞培养上清中VEGF、TGF-β1和IL-6的含量(pg/mL)。将所收集细胞抽提总RNA,采用RT-PCR法扩增目的片段VEGF、TGF-β1、IL-6和内参照β-actin,扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统上扫描分析,分别计算VEGF、TGF-β1和IL-6 mRNA相对表达量,表达强度以相对表达系数RC表示。全部实验重复三次,结果数据以三次重复实验的x±s表示。统计学分析采用t检验和单因素方差分析,以P<0.05为有统计学差异。结果:1不同浓度的葡萄糖对Colon26肿瘤细胞VEGF分泌的影响B(nG)组、C(mG)组和D(hG)组细胞培养上清中VEGF的浓度(分别为9.4167±0.4646,9.4667±0.1528和9.6167±0.2887),与A(Control)组细胞培养上清中VEGF的浓度(9.5583±0.2691)相比较,均无显著性差异(均为P>0.05)。显示所试三个浓度([5、10和25)mmol/L]的葡萄糖,对Colon26肿瘤细胞分泌VEGF均无影响。2不同浓度的胰岛素对Colon26肿瘤细胞VEGF分泌的影响G(hI)组细胞培养上清中VEGF的浓度(27.7667±0.2517),明显高于A(Control)组、E(nI)组和F(mI)组细胞培养上清中的VEGF浓度(分别为9.5583±0.2691,9.5833±0.0764和9.6167±0.1258),差异均有显著性(均为P<0.01);而A(Control)组、E组和F组三组之间,无显著性差异(P>0.05)。显示只有高浓度(125μIU/mL)胰岛素能显著增加Colon26肿瘤细胞VEGF的分泌。3不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合对Colon26肿瘤细胞VEGF分泌的影响K(nGhI)组和L(hGhI)组细胞培养上清中VEGF的浓度(分别为27.8333±0.3512和27.6000±0.6557),均明显高于A(Control)组细胞培养上清中的VEGF浓度(9.5583±0.2691),差异均有显著性(均为P<0.01);而K组与L组细胞培养上清中的VEGF浓度无差异(P>0.05)。H(nGnI)组、M(hGnI)组和N(hGloI)组细胞培养上清中VEGF的浓度(分别为9.7167±0.00289,9.8667±0.0577和9.9000±0.1732)与A组相比较均无显著性差异(均为P>0.05)。显示,不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合未明显改变各自单独对Colon26肿瘤细胞分泌VEGF的影响模式,仍显示为仅是加有高浓度(125μIU/mL)胰岛素者(K组和L组)能显著增加Colon26肿瘤细胞VEGF的分泌;两者联合,既无协同效应也无拮抗效应。4不同浓度的葡萄糖和胰岛素对Colon26肿瘤细胞VEGF基因转录的影响培养液中加有高浓度(125μIU/mL)胰岛素的G(hI)组、K(nGhI)组和L(hGhI)组:它们的VEGF mRNA扩增产物的电泳条带,与A(Control)组相比明显增粗变亮;它们的VEGF mRNA的表达(分别为0.8802±0.1900、0.8605±0.1800和0.8569±0.2200),与A组(0.4653±0.0200)相比均有显著性差异(均为P<0.01)。而其他组与A组相比,电泳条带在宽度和亮度上没有差异;且VEGF mRNA的表达与A组相比亦无显著性差异(均为P>0.05)。显示高浓度(125μIU/mL)的胰岛素显著增加Colon26肿瘤细胞VEGF的基因转录;提示上述高浓度的胰岛素显著增加Colon26肿瘤细胞分泌VEGF的分子机制,应是在基因水平提高VEGF mRNA转录所致。5不同浓度的葡萄糖对Colon26肿瘤细胞TGF-β1分泌的影响D(hG)组细胞培养上清中TGF-β1的浓度(863.12±20.26)明显高于A(Control)组(625.14±12.02),差异有显著性(P<0.01);而B(nG)组和C(mG)组细胞培养上清中TGF-β1的浓度(分别为635.51±16.97和632.52±17.88)与A组相比均无显著性差异(均为P >0.05 )。显示高浓度的葡萄糖显著增加Colon26肿瘤细胞分泌TGF-β1。6不同浓度的胰岛素对Colon26肿瘤细胞TGF-β1分泌的影响E(nI)组、F(mI)组和G(hI)组细胞培养上清中TGF-β1的浓度(分别为622.18±10.53、614.85±14.92和617.12±16.12)与A(Control)组(625.14±12.02)相比均无显著性差异(均为P>0.05)。显示所试三个浓度[(5、25和125)μIU/mL ]的胰岛素均不影响Colon26肿瘤细胞TGF-β1的分泌。7不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合对Colon26肿瘤细胞TGF-β1分泌的影响培养液中均加有高浓度(25mmol/L)葡萄糖的L(hGhI)组、M(hGnI)组和N(hGloI)组细胞培养上清中TGF-β1的浓度(分别为982.78±19.02、882.54±17.08和871.46±16.21)均明显高于A(Control)组(625.14±12.02),差异均有显著性(均为P<0.01);而培养液中均未加有高浓度葡萄糖的H(nGnI)组和K(nGhI)组细胞培养上清中TGF-β1的浓度(分别为626.18±15.98和630.18±18.95)与A组相比均无显著性差异(均为P>0.05)。这些结果显示,葡萄糖与胰岛素联合未改变各自单独作用模式,仍显示为仅高浓度葡萄糖显著增加Colon26肿瘤细胞TGF-β1的分泌;两者联合既无协效应同也无拮抗效应。8不同浓度的葡萄糖和胰岛素对Colon26肿瘤细胞TGF-β1基因转录的影响TGF-β1 mRNA的表达水平,在培养液加有高浓度(25mmol/L)葡萄糖的D (hG)组(0.768±0.017)、L组(0.889±0.028)、M (hGnI)组(0.764±0.027)和N (hGloI)组(0.752±0.035)均显著高于A组(0.540±0.012) (均P <0.01),而在培养液没加高浓度葡萄糖的B (nG)组(0.545士0.033)、C (mG)组(0.558±0.035)、E (nI)组(0.566±0.039)、F (mI)组(0.549±0.030)、G (hI)组(0.531±0.022)、H (nGnI)组(0.550±0.037)和K (nGhI)组(0.537±0.025)与A组相当(均为P>0.05)。显示只有高浓度(25mmol/L)的葡萄糖能增加Colon26肿瘤细胞的TGF-β1 mRNA转录;提示上述高浓度的葡萄糖能增加Colon26肿瘤细胞分泌TGF-β1的分子机制应是由在基因水平增加TGF-β1 mRNA转录所致。9不同浓度的葡萄糖对Colon26肿瘤细胞IL-6分泌的影响D(hG)组细胞培养上清中IL-6的浓度(27.70±1.53)明显高于A(Control)组(18.33±2.52),差异有显著性(P <0.01);而B(nG)组和C(mG)组细胞培养上清中IL-6的浓度(分别为19.33±2.31和22.67±0.58),与A组相比均无显著性差异(均为P >0. 05)。显示高浓度(25mmol/L)的葡萄糖显著提高Colon26肿瘤细胞IL-6分泌。10不同浓度的胰岛素对Colon26肿瘤细胞IL-6分泌的影响E(nI)组、F(mI)组和G(hI)组细胞培养上清中IL-6的浓度(分别为19.67±1.53、21.33±4.04和21.67±2.08)与A组(18.33±2.52)相比均无显著性差异(均为P>0. 05)。显示所试三个浓度([5, 25和125)μIU/mL]胰岛素均不影响Colon26肿瘤细胞分泌IL-6。11不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合对Colon26肿瘤细胞IL-6分泌的影响培养液中均加有高浓度(25 mmo1/L)葡萄糖的L(hGhI)组、M(hGnI)组和N(hGloI)组细胞培养上清中IL-6的浓度(分别为27.67±2.52、27.33±2.08和27.33±1.53)均明显高于A(Control)组(18.33±2.52),差异均有显著性(均为P<0.01),而培养液中均未加高浓度葡萄糖的H(nGnI)组和K(nGhI)组细胞培养上清中IL-6的浓度(分别为20.33±1.53和22.33±2.08)与A组相比均无显著性差异(均为P >0. 05)。显示,不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合未改变各自单独作用模式,仍是显示为高浓度的葡萄糖显著增加Colon26肿瘤细胞分泌IL-6;两者联合对Colon26肿瘤细胞分泌IL-6,既无协同也无拮抗效应。12不同浓度的葡萄糖和胰岛素对Colon26肿瘤细胞IL-6基因转录的影响D(hG)组IL-6 mRNA的表达(0.560±0.011)高于A(Control)组(0.406±0.012),差异有显著性(P<0.05);而B(nG)组和C(mG)组IL-6 mRNA的表达(分别为0.413±0.031和0.426±0.001)与A组相比均无显著性差异(均为P >0. 05)。E(nI)组、F(mI)组和G(hI)组IL-6 mRNA的表达(分别为0.416±0.002、0.422±0.013和0.426±0.016)与A组相比均无显著性差异(均为P>0.05)。培养液中均加有高浓度(25 mmo1/L)葡萄糖的L组、M组和N组的IL-6 mRNA表达(分别为0.560±0.011、0.560±0.011和0.563±0.002)均高于A组,差异均有显著性(均为P <0.05);而培养液中未加高浓度葡萄糖的H组和K组的IL-6 mRNA表达(分别为0.420±0.001和0.426±0.002)与A组相比均无显著性差异(均为P>0.05)。这些结果显示,高浓度的葡萄糖(25mmol/L)显著增加Colon26肿瘤细胞IL-6 mRNA转录;提示上述高浓度葡萄糖增加Colon26肿瘤细胞分泌IL-6的分子机制应是在基因水平增加Colon26肿瘤细胞IL-6 mRNA转录所致。结论:1高浓度(25mmol/L)的葡萄糖可显著增加Colon26肿瘤细胞分泌TGF-β1和IL-6,其分子机制应是由促进Colon26肿瘤细胞TGF-β1和IL-6基因转录所致。2不同浓度[(5—25)mmol/L]的葡萄糖对Colon26肿瘤细胞VEGF的分泌和基因转录无影响。3高浓度(125μIU/mL)的胰岛素可显著增加Colon26肿瘤细胞分泌VEGF,其分子机制应是由促进Colon26肿瘤细胞VEGF基因转录所致。4不同浓度[(1.25-125)μIU/mL]的胰岛素对Colon26肿瘤细胞TGF-β1和IL-6的分泌及基因转录无影响。5不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合,不改变各自单独对Colon26肿瘤细胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因转录的作用模式。6不同浓度的葡萄糖和胰岛素联合,对Colon26肿瘤细胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因转录,既无协同效应也无拮抗效应。7糖尿病自然病程中不同浓度的葡萄糖和胰岛素可显著增加结直肠癌肿瘤细胞某些免疫抑制物质分泌,应是糖尿病患者易患结直肠癌的内在分子机制之一。