【摘 要】
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水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzea)种下的2个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzea pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)在寄主水稻上
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水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzea)种下的2个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzea pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)在寄主水稻上分别引发水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)和水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS),是水稻上2种最重要的细菌性病害,其主要由hrp基因簇编码的III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中从而激发水稻的抗(感)病性。为了在水稻黄单胞菌中实现蛋白水平的定量检测,本研究以pHM1载体作为原始载体建立了一套可以应用于水稻黄单胞菌的蛋白水平检测体系。构建了蛋白表达载体pH1-flag、pH2-flag、pHM1-flag、pH1-3myc、pH2-3myc,分别选取Xoo中的hrpG基因以及Xoc中hrpG基因和hrpX作为目的基因进行蛋白表达水平检测实现了hrp基因在不同水平上的成功表达,为黄单胞菌中基因的蛋白表达水平研究及调控机制的揭示提供了研究基础和思路。细菌分裂受到很多调控子的调控作用,包括MinC、MinD和MinE共同组成的Min系统。为了对Min系统与hrp基因之间的调控机制进行解析,本研究利用前人构建的Min系统基因缺失突变体,通过Real Time PCR和Western blot杂交等技术手段分别在转录后水平和蛋白水平证明了MinCDE系统通过影响hrp基因簇上游调控基因hrpG和hrpX进而负调控整个hrp基因簇转录表达。引入Xoo毒性调控网络,发现MinCDE系统可能是通过正调控hrp基因的负向调控因子rpfG、colS和clp进而对hrp基因的转录表达进行负调控。表型检测显示,MinCDE系统相关基因突变体的游动性水平与野生型相比均显著下降,生物膜形成量明显增多,证实MinCDE系统缺失会影响Xoo的游动性和生物膜形成。本课题通过构建能够应用于水稻黄单胞菌中的蛋白水平检测体系,实现基因不同水平表达,为后续表达调控研究、突变体互补以及基因功能研究提供了有效的工作体系;同时对MinCDE系统负调控T3SS基因表达的机理进行深入探究,将与细胞分裂相关的Min系统和致病性相关的T3SS联系起来,为T3SS上游调控网络的揭示提供了新的思路。
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