μ-钙蛋白酶是宰后肉嫩化的关键酶,研究表明活体中μ-钙蛋白酶存在磷酸化修饰现象,磷酸化影响μ-钙蛋白酶活性,但在宰后肌肉中μ-钙蛋白酶是否会发生磷酸化,磷酸化如何影响μ-钙蛋白酶活性值得探讨。本文以羊背最长肌为实验材料,解析嫩度差异羊肉中肌浆蛋白磷酸化水平与μ-钙蛋白酶活性及钙蛋白酶抑制蛋白降解之间的关系;通过添加碱性磷酸酶和磷酸酶抑制剂调控肌浆蛋白的磷酸化水平,确证肌浆蛋白磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响;离体模型中调控μ-钙蛋白酶的磷酸化水平,验证磷酸化和去磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响,解析μ-钙蛋白酶二级结构的变化并确证μ-钙蛋白酶的磷酸化位点,揭示磷酸化和去磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的直接调控机制;研究钙蛋白酶抑制蛋白对磷酸化的μ-钙蛋白酶、磷酸化的钙蛋白酶抑制蛋白对μ-钙蛋白酶活性的调控作用,从磷酸化对二者相互作用角度阐明蛋白质磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的间接调控机制。具体研究结果如下:(1)解析了嫩度差异羊肉中肌浆蛋白磷酸化水平与μ-钙蛋白酶活性及钙蛋白酶抑制蛋白降解之间的关系。嫩度高的肌肉中肌浆蛋白磷酸化水平低,μ-钙蛋白酶降解程度高、活性高,钙蛋白酶抑制蛋白降解失活速度快,表明肌浆蛋白磷酸化可能通过影响μ-钙蛋白酶活性或通过钙蛋白酶抑制蛋白影响μ-钙蛋白酶活性进而影响宰后肉嫩度。(2)明确了肌浆蛋白磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响。通过外加碱性磷酸酶广谱催化去磷酸化反应和磷酸酶抑制剂广谱抑制去磷酸化反应进而调控肌浆蛋白的磷酸化水平,结果表明肌浆蛋白磷酸化水平低,μ-钙蛋白酶降解速度快,活性高;肌浆蛋白磷酸化水平高,μ-钙蛋白酶降解速度慢,活性低;且温度升高或Ca2+浓度升高均会削弱磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响。因此,进一步确证了肌浆蛋白磷酸化水平负向调控μ-钙蛋白酶活性。(3)确证了碱性磷酸酶去磷酸化和蛋白激酶A催化磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的正向调控作用。μ-钙蛋白酶经碱性磷酸酶和蛋白激酶A处理后,在冰温(-1℃)、4℃、25℃和37℃下孵育。蛋白激酶A催化的磷酸化提高μ-钙蛋白酶活性,同时广谱去磷酸化也提高μ-钙蛋白酶活性。冰温通过抑制磷酸化和去磷酸化反应,延缓了μ-钙蛋白酶的降解和激活,而温度升高通过加速μ-钙蛋白酶的降解和激活过程削弱了磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的影响。(4)解析了碱性磷酸酶催化的去磷酸化和蛋白激酶A催化的磷酸化调控μ-钙蛋白酶活性的机制。μ-钙蛋白酶经碱性磷酸酶和蛋白激酶A处理后,在0.01、0.03、0.05和0.1 m M Ca2+浓度下孵育,验证了碱性磷酸酶催化的去磷酸化和蛋白激酶A催化的磷酸化对μ-钙蛋白酶活性的正向调控作用。随着磷酸化水平升高,μ-钙蛋白酶α-螺旋结构含量升高,与对照组相比,碱性磷酸酶去磷酸化和蛋白激酶A催化磷酸化的μ-钙蛋白酶β-折叠含量低、无规则卷曲含量高,低含量的β-折叠和高含量的无规则卷曲结构可能有利于激活μ-钙蛋白酶。鉴定到μ-钙蛋白酶5个磷酸化位点,分别为Ser 255、256、417、420、476,其中,蛋白激酶A催化的μ-钙蛋白酶Ser 255、256、476位点可能通过改变μ-钙蛋白酶的催化蛋白水解能力、活性调节能力提高μ-钙蛋白酶的活性。(5)明确了钙蛋白酶抑制蛋白对磷酸化的μ-钙蛋白酶活性的影响。分别取25、50、100和150 units经碱性磷酸酶或蛋白激酶A处理过的μ-钙蛋白酶与等量含钙蛋白酶抑制蛋白的热稳定蛋白混合孵育。虽然碱性磷酸酶催化的去磷酸化和蛋白激酶A催化的磷酸化正向调控μ-钙蛋白酶活性,但钙蛋白酶抑制蛋白对蛋白激酶A催化的磷酸化μ-钙蛋白酶活性的抑制能力更强,总体表现为碱性磷酸酶催化的去磷酸化正向调控μ-钙蛋白酶活性,蛋白激酶A催化的磷酸化虽然提高μ-钙蛋白酶活性,但钙蛋白酶抑制蛋白对磷酸化的μ-钙蛋白酶更强的抑制作用使得蛋白激酶A催化的磷酸化总体上负向调控μ-钙蛋白酶活性。(6)进一步明确了磷酸化的钙蛋白酶抑制蛋白调控μ-钙蛋白酶活性的机制。含钙蛋白酶抑制蛋白的热稳定蛋白经碱性磷酸酶和蛋白激酶A处理,分别与25、50、100和150 units的μ-钙蛋白酶离体孵育。磷酸化水平高,钙蛋白酶抑制蛋白的抑制能力更强。共鉴定到钙蛋白酶抑制蛋白2个磷酸化肽段(1个磷酸化差异肽段),含5个磷酸化位点(1个磷酸化差异位点)。蛋白激酶A催化的钙蛋白酶抑制蛋白位于结构域IV中A子域的磷酸化差异位点Ser 649通过促进钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶的相互作用正向调控钙蛋白酶抑制蛋白的抑制能力,进而抑制μ-钙蛋白酶活性。