背景:银屑病(psoriasis)是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病,可发生于任何年龄,皮损特征为境界清楚的红斑、斑块,覆有肥厚银白色鳞屑。其患病率因种族、地理位置等因素的不同有很大差别,欧美的患病率约1%～3%,上个世纪八十年代,流行病学调查发现我国银屑病的患病率为0.123%,近年来有增加的趋势。银屑病病因及发病机制复杂,是由免疫介导的多基因遗传性皮肤病,精神创伤、感染、气候及药物等均能诱发本病。在组织学上,银屑病具有几个独特的特征,例如表皮角质形成细胞过度增殖并异常分化,明显的T淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞浸润及真皮乳头部血管扭曲扩张水肿等。随着人们对银屑病研究的逐渐深入,认为银屑病不但是一种皮肤病,还是一种系统性疾病,可伴发多种疾病,如代谢综合征、胃肠道损伤、心血管疾病等,严重影响患者的身心健康及生活质量。本病病程长,易反复,治疗主要有光化学疗法,局部外用类固醇、免疫抑制剂等,系统治疗药物有阿维A、甲氨蝶呤、环孢菌素、生物制剂等。目前的治疗虽然有效,但是由于副作用及价格昂贵限制了许多药物的使用。二甲双胍(Metformin,1,1-二甲基双胍盐酸盐,MET)是口服降糖药,因其降糖作用和降低心血管发病率和死亡率的能力,通常用于治疗2型糖尿病。除了降糖作用外,二甲双胍还能抑制许多类型肿瘤细胞的生长和增殖,包括肝癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌。近年来,有许多学者发现该药治疗银屑病、代谢综合征等亦有很好的疗效。有报道称,二甲双胍可以抑制T细胞增殖和IFN-γ,IL-17的分泌。与其他胰岛素敏感剂不同,二甲双胍可显著降低糖尿病患者银屑病的发生。另外,与安慰剂相比,二甲双胍可以显着改善银屑病患者皮损面积和严重程度指数评分。活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)是可以调节细胞信号传导和维持体内平衡的活性分子。一般而言,氧化应激条件下ROS的升高通过破坏细胞成分可参与各种疾病的发生,包括癌症和炎症。然而,目前越来越多的证据表明ROS在肿瘤中具有双重作用,较低水平的ROS可促进细胞存活和肿瘤发生,而ROS水平升高可诱导肿瘤细胞凋亡或衰老,抑制癌细胞生长。有学者研究,在甘露聚糖诱导的炎症中,ROS的缺乏能促进银屑病和关节炎的进展。此外,在蒽林(最有效的局部用药物)和光疗治疗银屑病的过程中,ROS的产生在其中发挥了主要作用。ROS还能缓解咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎。有不少学者认为,二甲双胍的抗肿瘤活性就与ROS的产生有关。在体外,二甲双胍能增加过氧化氢的产生并降低神经元细胞线粒体活力。核因子E2相关转录因子2(Nrf2)是一种转录因子,可以调节Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白如超氧化物歧化酶,过氧化氢酶和血红素加氧酶-1等的表达,调节细胞对氧化应激的防御。由Nrf2及其阻遏蛋白调控的诱导型抗氧化剂程序可以严密控制ROS 水平。最近,来自几个研究小组的研究表明,Nrf2作用的靶基因实际上比先前认为的更为广泛,并且包含一些调节细胞增殖和分化的基因。例如,已经证实Nrf2可通过上调代谢基因来增强癌细胞增殖。在大量的恶性肿瘤中,Nrf2表现出活性增加,包括结肠癌,肺癌,乳腺癌,和胰腺癌。文献报道,Nrf2还可以调节促进角质形成细胞过度增殖的关键标志物的表达,所以Nrf2的失调可能参与了银屑病的发病机制。丝裂原活化蛋白(MAP)激酶超家族,其由细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和三个应激反应亚族,c-JunNH2-末端激酶(JNK),p38-激酶和ERK-5组成,通常由生长因子和细胞应激或炎性细胞因子刺激。ERK1/2是MAPK家族中重要的信号传导途径,能调节细胞的生长和分化,通过Ras-Raf-Mek级联激活。ERK1/2信号通路与银屑病密切相关。在人类癌细胞中,已被证明Raf/ERK信号通路可以激活Nrf2与其靶蛋白启动子之间的相互作用,以促进Nrf2核易位和绑定到特定的DNA序列。在癌细胞中MET可以通过Raf-ERK信号通路失活来减少Nrf2的表达。文献报道,二甲双胍能通过抑制Raf-ERK-Nrf2信号通路抑制HO-1的表达从而抑制癌细胞生长。该研究提供了二甲双胍可能参与癌症预防的证据,并确定了用该药物治疗的糖尿病患者中降低癌症风险的机制。二甲双胍可以从多层面调节机体免疫功能。我们以往的研究也表明二甲双胍可通过抑制mTOR信号通路发挥对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的抗增殖作用。二甲双胍的抗肿瘤活性与活性氧的产生有关。那么活性氧是否参与了二甲双胍对角质形成细胞增殖的影响,及Raf-ERK-Nrf2信号通路是否也在其中发挥作用,目前尚无相关基础研究。本课题通过体外细胞实验,检测二甲双胍对HaCaT角质形成细胞活性、凋亡及对其产生活性氧水平的影响,并通过分子生物学的方法对其涉及的信号转导途径进行初步研究,为今后二甲双胍作为一种抗角质形成细胞增殖的药物应用于临床治疗银屑病打下基础。第一部分二甲双胍对HaCaT角质形成细胞活性及活性氧水平的影响目的:观察二甲双胍药物刺激后实验组及对照组细胞的形态学变化,并运用CCK-8法和流式细胞检测方法,检测二甲双胍对HaCaT角质形成细胞活性、凋亡及活性氧水平的影响。方法:1.分为不同浓度二甲双胍实验组、对照组。HaCaT角质形成细胞分别以2x105/ml的密度接种。37℃在5%(C02孵箱中培养过夜。以0、10、20、40、60mmol/L不同浓度的二甲双胍分别对体外培养的HaCaT角质形成细胞进行药物刺激,在刺激后24h,(1)CCK-8法检测各组细胞的活性情况。(2)用不含EDTA的0.25%胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,Annexin V-FITC标记,应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。(3)DCFH-DA探针标记,胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,应用流式细胞仪检测各组细胞活性氧水平。2.活性氧清除剂NAC预处理下,二甲双胍对HaCaT细胞产生活性氧(ROS)、细胞活性及凋亡的影响。分对照组、二甲双胍组、二甲双胍+NAC组。二甲双胍+NAC组先用终浓度为10mM的NAC溶液预处理1小时。(1)活性氧(ROS)的影响。在刺激后24h,DCFH-DA探针标记,胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,应用流式细胞仪检测各组细胞活性氧水平。(2)在刺激后24h,CCK-8法检测各组细胞的活性情况。(3)在刺激后24h,用不含EDTA的0.25%胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,Annexin V-FITC标记,应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。结果:(1)CCK-8法检测不同浓度二甲双胍对HaCaT细胞活性的影响。结果显示,对照组、10mM、20mM、40mM、60mM二甲双胍组细胞的平均存活率分别为100.00±0.00%、99.27±0.46%、78.77±2.00%、70.47±1.43%和 29.57±2.31%。与对照组相比,10mM二甲双胍组细胞的活性无明显变化(P>0.05)。当二甲双胍浓度≥20mM时,能明显抑制HaCaT细胞的生长,并呈浓度依赖性,与对照组相比,P<0.01,差异有统计学意义。(2)二甲双胍对HaCaT角质形成细胞形态的影响。倒置显微镜下观察二甲双胍作用前后HaCaT细胞生长状态,对照组和10mM二甲双胍组细胞大小均匀一致,较饱满,细胞边界清楚,簇集分布,贴壁生长,细胞间连接较紧密。经过用≥20mM二甲双胍干预24h以后,细胞的形态学发生明显的变化,细胞体积变小,细胞之间粘附性降低,多单个分布,部分细胞脱落、漂浮,贴壁生长的细胞内颗粒、空泡增多。培养液中可见细胞及细胞碎片漂浮,细胞凋亡增加。随着二甲双胍浓度增大,这种细胞抑制作用更为明显。(3)流式细胞仪检测不同浓度二甲双胍对HaCaT细胞凋亡的影响。用浓度为0、10mM、20mM、40mM、60mM的二甲双胍干预HaCaT细胞24h后,进行流式细胞检测细胞凋亡发现,对照组、10mM、20mM、40mM、60mM二甲双胍组细胞的平均凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡细胞之和)分别为6.15±0.55%、6.11±0.51%、11.53±0.57%、36.13±0.7 1%、55.41±2.93%。与对照组相比,10mM 二甲双胍组细胞的凋亡细胞数无显著变化(P>0.05)。当二甲双胍浓度≥20mM时,开始凋亡的细胞增多,并呈浓度依赖性,与对照组相比,P<0.01,差异有统计学意义。结论:在体外,二甲双胍能抑制HaCaT角质形成细胞的生长、增殖,并能诱导其凋亡,这种细胞生长抑制作用呈浓度依赖性。(4)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后,用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平,结果显示,当浓度是20、40、60 mM时,细胞内平均活性氧水平分别是对照组的1.81、3.59、7.84倍。说明二甲双胍能提高HaCaT细胞产生活性氧(ROS)的水平,并有浓度依赖性。与对照组相比,P<0.01,差异有统计学意义。(5)在40mM二甲双胍作用于HaCaT细胞24小时之前,先用10mM活性氧清除剂NAC预处理1小时。倒置显微镜下观察HaCaT细胞生长状态,用活性氧清除剂NAC预处理组细胞形态与单纯40mM二甲双胍组相比较,其细胞生长状态明显好转,脱落、漂浮的细胞明显减少(6)活性氧清除剂NAC预处理下,二甲双胍对HaCaT细胞产生活性氧(ROS)、细胞活性及凋亡的影响。结果显示,与单纯二甲双胍组相比,其平均活性氧水平减少约44.67%,细胞平均活力从69.87±0.32%升至90.95±1.01%,凋亡细胞平均百分比亦从35.70±0.97%下降至18.32±0.67%。P<0.01,差异有统计学意义。实验结果证明用活性氧清除剂NAC提前作用于HaCaT细胞后,二甲双胍刺激HaCaT细胞产生活性氧的能力减弱,细胞生长状态明显好转,并且抑制细胞增殖与促细胞凋亡的能力亦减弱。结论:二甲双胍通过提高HaCaT细胞内活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用,并呈浓度依赖性。第二部分二甲双胍调控Nrf2对HaCaT角质形成细胞活性及活性氧水平的影响目的:应用Western blot、实时荧光定量PCR检测不同浓度二甲双胍对Nrf2、p-Nrf2蛋白水平、Nrf2mRNA水平表达的影响;Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞,检测其产生活性氧(ROS)水平及增殖、凋亡的变化。探讨二甲双胍促HaCaT细胞凋亡的分子作用机制。方法:取对数生长期的HaCaT角质形成细胞以2X 105/ml密度接种培养过夜。1.应用Western blot、实时荧光定量PCR检测不同浓度二甲双胍对Nrf2、p-Nrf2蛋白水平、Nrf2mRNA水平表达的影响。实验分为不同浓度二甲双胍实验组、对照组。24h后,以0、10、20、40、60mmol/L不同浓度的二甲双胍对其进行药物刺激。(1)在药物作用24h后,分别抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜,用5%脱脂奶粉封闭非特异抗原,加入Nrf2、p-Nrf2一抗,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次后,加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h,显色后化学发光系统采集图像。实验以GAPDH作为内参照。(2)在药物作用24h后,分别抽提细胞总RNA,RNA定量,RNA反转录为cDNA,放入荧光定量PCR仪进行反应。2.Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞,检测对其增殖、凋亡及产生活性氧(ROS)的影响,分对照组、二甲双胍组(终浓度为40mM)、二甲双胍(终浓度为40mM)+OPZ(终浓度为25uM)组。(1)活性氧(ROS)的影响。在刺激后24h,DCFH-DA探针标记,胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,应用流式细胞仪检测各组细胞活性氧水平。(2)在刺激后24h,CCK-8法检测各组细胞的活性情况。(3)在刺激后24h,用不含EDTA的0.25%胰酶消化HaCaT细胞并收集于流式管,Annexin V-FITC标记,应用流式细胞检测各组细胞的凋亡状况。结果:(1)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后,Western-blot检测HaCaT细胞Nrf2、p-Nrf2蛋白水平。结果显示,与对照组比较,浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组,Nrf2蛋白相对水平分别平均下降32.73%、54.17%和60.24%;p-Nrf2蛋白水平分别平均下降26.39%,35.51%,49.51%。P<0.01,差异有统计学意义。(2)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后,qRT-PCR检测HaCaT细胞Nrf2mRNA水平。结果显示,与对照组比较,浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组,Nrf2mRNA相对表达水平分别平均下降17.64%、30.30%和43.400%。P<0.01,差异有统计学意义。(3)Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞24h后,倒置显微镜下观察HaCaT细胞生长状态,与单纯二甲双胍组(40mM)相比较,其细胞生长状态明显好转,细胞大小一致,脱落、漂浮的细胞明显减少。(4)Nrf2激动剂oltipraz(OPZ)与二甲双胍共同作用于HaCaT细胞24h后,与单纯二甲双胍组相比,其平均活性氧水平减少约42.46%,细胞平均活力从71.07±1.39%升至86.57±0.96%,凋亡细胞平均百分比亦从35.70±0.97%下降至24.13±0.95%。P<0.01,差异有统计学意义。结论:二甲双胍通过降低细胞Nrf2的表达升高活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用。第三部分二甲双胍对HaCaT角质形成细胞Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路活性的影响目的:应用Western-blot检测不同浓度二甲双胍对RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平表达的影响及MEK抑制剂U0126对ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2蛋白水平表达的影响。进一步探讨二甲双胍促HaCaT细胞凋亡的分子作用机制。方法:取对数生长期的HaCaT角质形成细胞以2X 105/ml密度接种培养过夜。1.应用Western-blot检测不同浓度二甲双胍对RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平表达的影响,在药物作用24h后,分别抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜,用5%脱脂奶粉封闭非特异抗原,加入 RAF-1、p-RAF-1、ERK1/2 及 p-ERK1/2一抗,4℃孵育过夜,TBST 洗涤3次后,加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h,显色后化学发光系统采集图像。实验以GAPDH作为内参照。2.Western-blot 检测 MEK 抑制剂 U0126 对 ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2 及 p-Nrf2蛋白水平表达的影响。分对照组、0.1%DMS0组、U0126组(终浓度为10uM)。在药物作用24h后,分别抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜,用5%脱脂奶粉封闭非特异抗原,加入ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2一抗,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,加入含辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗反应1h,显色后化学发光系统采集图像。实验以GAPDH作为内参照。结果:(1)不同浓度二甲双胍作用于HaCaT细胞24h后,Western-blot检测HaCaT细胞RAF-1、ERK1/2、p-RAF-1及p-ERK1/2蛋白水平。结果显示,浓度为20、40、60mmol/L的二甲双胍组,RAF-1蛋白水平分别平均下降16.90%、56.35%和79.45%;p-RAF-1 蛋白水平分别平均下降 28.76%、60.10%、81.97%;ERK1/2 蛋白水平分别平均下降29.87%、36.46%、63.37%;p-ERK1/2蛋白水平分别平均下降17.34%、35.46%、49.48%。与对照组比较,P<0.01,差异有统计学意义。(2)用 MEK 抑制剂 U0126(10uM)作用于 HaCaT 细胞 1h 后,Western-blot 检测其ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2蛋白水平的表达。结果显示,与对照组相比,ERK1/2、p-ERK1/2、Nrf2及p-Nrf2蛋白水平均下降,平均下降分别为26.94%、28.06%、21.78%、33.04%,与对照组比较,P<0.01,差异有统计学意义。结论:二甲双胍通过抑制Raf-1/ERK1-2信号通路的活性而降低Nrf2的表达。与目前已有的报道相比较,本文的创新点主要在以下几个方面:(1)首次就二甲双胍对HaCaT细胞活性氧水平的表达来探讨其对HaCaT细胞增殖、凋亡作用的影响,并证实二甲双胍通过提高HaCaT细胞内活性氧水平而发挥抑制细胞增殖、促细胞凋亡作用,并有浓度依赖性。(2)首次就二甲双胍对HaCaT细胞Nrf2水平的表达来探讨其对HaCaT细胞增殖、凋亡作用的影响,并证实二甲双胍可以抑制Nrf2和p-Nrf2蛋白水平及Nrf2mRNA水平的表达,通过抑制HaCaT细胞Nrf2的表达提高细胞内活性氧水平而发挥促细胞凋亡作用的。(3)首次就二甲双胍、HaCaT细胞活性氧(ROS)水平、Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路、HaCaT细胞活性之间的关系进行系统实验研究,并证实二甲双胍通过抑制HaCaT细胞Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路活性而提高细胞内活性氧水平,进一步发挥其促细胞凋亡的作用。本论文较为详尽地研究了二甲双胍、HaCaT角质形成细胞活性氧(ROS)水平、Raf-1-ERK1/2-Nrf2信号通路、HaCaT细胞活性之间的关系,为它们作为治疗银屑病的新靶点提供了实验和理论基础。探讨二甲双胍对角质形成细胞作用的具体分子机制,将有利于我们进一步了解此药,为其作为银屑病的治疗方案提供更为有力和直接的证据,具有一定的理论意义与实际价值。