猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)属于细小病毒科、细小病毒属成员,是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原。PPV能感染多种猪原代和传代细胞,其中猪胎盘滋养层细胞(placental trophoblast cells,PTCs)是其主要靶细胞。PTCs是构成猪胎盘屏障的重要组成部分,在胎盘形成和胎儿发育过程中发挥重要的生理和免疫保护功能。本实验室前期研究证实,PPV感染PTCs可引起细胞自噬和细胞凋亡,然而PPV引起的PTCs自噬与细胞凋亡之间的关系,以及PPV感染PTCs中是否存在细胞自噬性死亡,迄今尚不清楚。本论文首先探讨PPV感染诱导PTCs自噬和细胞凋亡之间的关系,进一步检测PPV感染PTCs是否引起细胞自噬性死亡,并明确这种细胞死亡方式的特征,最后,研究细胞自噬对PPV诱导PTCs自噬性死亡的影响。研究取得以下结果。1.以1 MOI PPV感染PTCs,DNA Ladder检测结果显示,PPV感染36 h.p.i.,PTCs染色体DNA开始出现片段化,且在48 h.p.i.、60 h.p.i.、72 h.p.i.都能检测到明显的细胞染色体DNA片段化。流式细胞术检测结果显示,与感染0 h相比,PPV感染PTCs12 h.p.i.细胞凋亡率极显著升高(p<0.01),24 h.p.i.和36 h.p.i.细胞凋亡率均极显著升高(p<0.01)。caspase活性检测结果显示,与感染0 h相比,PPV感染12 h.p.i.细胞中caspase-3和caspase-9活性显著增加(p<0.05),24 h.p.i.和36 h.p.i.极显著增加(p<0.01)。结果表明,PPV感染能够诱导PTCs凋亡。以自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA,100 n M)或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3methyladenine,3-MA,5 m M)分别预处理PTCs后,1 MOI PPV感染细胞24 h.p.i.,细胞凋亡检测结果显示,与对照组比较,用3-MA抑制细胞自噬后PPV感染PTCs中caspase-3和caspase-9的活性无显著差异(p>0.05),细胞凋亡率显著增加(p<0.05);用RAPA诱导细胞自噬使PPV感染PTCs中caspase-3和caspase-9的活性水平极显著降低(p<0.01),细胞凋亡率显著降低(p<0.05)。结果表明,诱导细胞自噬可以抑制PPV诱导的细胞凋亡发生,而抑制细胞自噬则促进了PPV诱导细胞凋亡。2.1 MOI PPV感染PTCs,流式细胞术检测细胞死亡率,结果显示,PPV感染24h.p.i.细胞死亡率达到31.23%±1.98%,利用caspase特异性抑制剂z VAD-fmk(10 m M)预处理PTCs后,PPV感染仍能引起10.71%±1.12%的细胞死亡,提示在PPV感染的细胞中存在非凋亡通路介导的其它细胞死亡形式。在z VAD-fmk存在的情况下,以5m M 3-MA或100 n M RAPA预处理PTCs,在PPV感染PTCs 24 h.p.i.,3-MA抑制细胞自噬使PPV感染引起的细胞死亡率显著降低(p<0.05);RAPA诱导细胞自噬使细胞死亡率显著升高(p<0.05);特异性si ATG5抑制细胞自噬能使PPV感染引起的细胞死亡率显著降低(p<0.05)。这些结果表明PPV感染能诱导PTCs自噬性死亡。流式细胞术检测PPV感染PTCs溶酶体膜通透性变化,结果显示,1 MOI PPV感染PTCs24 h.p.i.细胞中lysosome tracker DND26平均荧光强度(DND26 MFI)显著降低(p<0.05),z VAD-fmk预处理细胞后,PPV感染亦引起PTCs中DND26 MFI显著降低(p<0.05),但是在z VAD-fmk存在的情况下,3-MA预处理后PPV感染PTCs中DND26MFI与Mock细胞相比无明显变化(p>0.05)。western blotting结果显示,PPV感染促进组织蛋白酶D和组织蛋白酶L从溶酶体释放到细胞浆中,且3-MA能显著减少PPV感染细胞胞浆中的组织蛋白酶D和L(p<0.05),而z VAD-fmk则没有这种作用。这些结果表明,PPV感染PTCs可以诱导以溶酶体损伤为特征的细胞自噬性死亡。3.流式细胞术检测1 MOI PPV感染72 h内PTCs死亡率和溶酶体膜通透性变化,结果显示,在z VAD-fmk预处理后,随着感染时间延长细胞死亡率不断增加,与感染0 h相比,PPV感染PTCs 24 h.p.i.、48 h.p.i.和72 h.p.i.细胞死亡率均极显著增加(p<0.01),与细胞死亡率结果一致,PPV感染PTCs 24 h.p.i.细胞中DND26 MFI显著降低(p<0.05),48 h.p.i.和72 h.p.i.极显著降低(p<0.01),这表明PPV感染引起的以溶酶体损伤为特征的细胞自噬性死亡率呈时间依赖性。细胞自噬性死亡率检测结果显示,与PPV感染组相比,100 n M RAPA预处理诱导PTCs完全自噬使PPV感染PTCs的自噬性死亡率显著增加(p<0.05),DND26 MFI显著降低(p<0.05),但是100 n M RAPA&100 n M BAF预处理诱导PTCs不完全自噬,对PPV感染PTCs的自噬性死亡率和DND26荧光强度无明显影响(p>0.05)。western blotting结果显示,与DND26 MFI变化一致,在72 h.p.i.,细胞中组织蛋白酶D和组织蛋白酶L从溶酶体释放到细胞浆中,且与PPV感染组细胞相比,RAPA预处理诱导细胞完全自噬促进组织蛋白D和组织蛋白L向细胞浆中释放(p<0.05),而RAPA&BAF预处理诱导细胞不完全自噬对PPV感染细胞中组织蛋白D和组织蛋白L的释放无明显影响(p>0.05)。上述结果表明,诱导细胞完全自噬促进PPV感染引起的PTCs自噬性死亡,而诱导细胞不完全自噬对PTCs自噬性死亡无明显影响。本研究明确了诱导PTCs自噬可以抑制PPV诱导的细胞凋亡,而抑制PTCs自噬促进了PPV诱导细胞凋亡。发现了PPV感染引起了以溶酶体损伤为特征的PTCs自噬性死亡。进一步研究发现,细胞完全自噬促进PPV诱导的PTCs自噬性死亡,而细胞不完全自噬对PTCs自噬性死亡无明显影响。研究结果阐明了PPV诱导PTCs自噬与凋亡的关系以及不同细胞自噬对PPV诱导PTCs自噬性死亡的影响,为进一步揭示PPV的致病机制提供了理论依据。