L-色氨酸（L-tryptophan,L-trp）是多种生物活性成分的前体,在医药行业、食品行业以及环境保护行业等方面的使用广泛,随着近年来国内外市场需求的不断增大,L-trp的探究逐步成为新的热点领域。目前,国内外市场L-trp需求量每年在数万吨左右,而且每年增长速度以10%递增。然而,由于从葡萄糖到L-trp的代谢途径长的原因,使正常情况下流向L-trp的代谢流较弱,普通检测设备基本检测不到目的产物,并且多种L-trp合成所必需的前体物以及复杂的生物调节调控机制限制了色氨酸的产量。近几年来,代谢工程以及基因工程新技术日新月异的发展,使人们通过研究L-trp的代谢途径及调控机制,消除或减弱支路代谢竞争压力,引入外源基因或过表达内源基因,成功构建了高产L-trp的工程菌株。大肠杆菌因其遗传背景显著、遗传改造简单且容易培养等优势,被广泛应用于代谢工程改造方面。由于复杂且繁多的因素限制了L-trp合成量的积累,本项研究运用理性代谢工程方法在基因组水平进行改造,成功构建了一株能够高效生产L-trp并且遗传稳定的大肠杆菌菌株。首先,通过诱变筛选得到一株能够生产L-trp的出发菌株KW。然后,通过过表达L-trp操纵基因（trpEDCBA）和3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(aroG^fbr),构建了一株能够生产L-trp的高产菌株。接着,运用CRISPR/cas9技术依次敲除ptsH,trpR和pykF/pykA,并删除了色氨酸衰减子以提高中间代谢物的积累。最后,为了提高葡萄糖的转运速率和转化效率,组合调控了galP和glk,并以减少醋酸的积累为目的,利用RNAi技术弱化了pta的表达水平。结果表明,与原始菌株相比,最终构建的工程菌株KW023可高效生产L-trp。在5 L发酵罐发酵48 h后,L-trp的积累量达到了39.7 g/L,最高转化率为16.7%,生产效率达到1.6 g/L/h。本研究通过理性分析,构建了高效生产L-trp的大肠杆菌工程菌株,为色氨酸的工业化生产提供了重要的研究价值。