论文部分内容阅读
现在,纳米生物材料正处于迅猛发展的时期。静电纺丝技术是制备纳米生物材料的有效方法,正在吸引越来越多研究者的关注。静电纺纳米纤维膜的结构类似于细胞外基质的结构,这种结构有利于细胞在上面的粘附和增殖。但是,静电纺纳米纤维膜不适合细胞的三维长入,在应用于病损组织修复时存在一定的局限性。把纳米纤维加捻在一起可以得到纳米纱,纳米纱的表面具有纳米纤维膜的结构特征,可以仿生细胞外基质。把纳米纱加工成膜,就可得到具有较大孔径和较大孔隙率的纳米纱支架。这种支架的孔隙率比纳米纤维膜的要大一些,孔径的大小和细胞直径在同一数量级。纳米纱支架上的孔是由纤维之间的沟壑形成的,这些孔几乎都是连续的,从而能使细胞在支架内部深度渗入。 本研究中,我们首先通过传统静电纺丝工艺,制备了P(LLA-CL)纳米纤维支架和胶原蛋白(COL)含量不同的 COL/P(LLA-CL)纳米纤维支架,研究了它们的基本性能,发现胶原蛋白的加入会降低纤维的直径和支架的力学性能;当胶原蛋白含量为25%时,支架表现出了一定的亲水性。通过动态流体静电纺丝工艺,我们制备得到了平行排列的 P(LLA-CL)纳米纱支架(NYS-P)和 COL/P(LLA-CL)纳米纱支架(NYS-CP)。两者都是由较粗的纤维构成,纤维和纤维之间存在沟壑。不同的是,含有胶原蛋白的NYS-CP支架的单根纤维上,可以看到较多的向外延伸的纳米纤维,这种特殊的结构,可以较好地仿生细胞外基质,有利于细胞的粘附。结合前期的研究,我们采用传统静电纺丝工艺和动态流体静电纺丝工艺,使用胶原蛋白含量为25%的COL/P(LLA-CL)共混物制备出了内径为4mm左右的双层管状支架(BLTS),这种支架的外层是疏松的纳米纱层;内层是致密的纳米纤维层。用SEM观察支架的横截面,发现内外层的分界面比较清晰,两者结合得也比较紧密。力学性能测试结果显示,管状支架结合了内外层的各自特点,表现出了良好的力学性能。 体外生物相容性测试以猪髋内皮细胞(PIEC)和小鼠成纤维细胞(L929)为种子细胞。MTT结果表明,胶原蛋白的加入可以增加支架的生物相容性;细胞在纳米纱支架上的增殖速度比在纳米纤维支架上的要快一些,这是因为纳米纱支架具有较大的孔隙率,能提供给细胞更大的生长空间。细胞粘附实验和生长形态的观测结果表明,内皮细胞经过6个小时就可以粘附到COL/P(LLA-CL)纳米纤维支架上;经过24个小时,细胞就能完全在支架上伸长开,表现出了良好的生长形态;经过4天,细胞已经互相长在了一起,形成了内皮组织类似物;经过7天,内皮细胞长成了一厚厚的组织。兔子体内生物相容性实验结果表明,纳米纱支架的大孔结构很适合细胞的深度长入和组织的再生。 我们从大鼠活体中分离得到了气管上皮细胞和软骨细胞,然后将两种细胞先后种植在BLTS支架上,放置于细胞培养箱里培养7天,发现BLTS支架的外表面生成了软骨类似物。把种有细胞的BLTS支架包埋于健康SD大鼠的气管筋膜内2周,进行预血管化处理。然后把预血管化的BLTS支架、只种有细胞的BLTS支架、未经任何处理的BLTS支架原位移植到了大鼠体内的气管缺损。HE切片结果表明:细胞均可以长入到各组BLTS支架的纳米纱层,且经过预血管化处理的BLTS支架更有利于组织的再生,还可以使支架保持较好地形状。流式细胞检测结果表明:经预血管化处理的BLTS支架在大鼠体内的免疫原性明显降低。CK免疫荧光和特殊染色实验表明:上皮细胞在经预血管化处理的BLTS支架上的生存状态较好,合成了上皮角蛋白抗原CK,预血管化处理后的支架更有利于组织再生。