随着人类社会的发展和工农业生产规模的扩大,人类排放到水环境中的污染物越来越多。在众多的污染物中,有机污染物占的比例最大,而有机物中的持久性有机污染物是一类环境滞留时间长、难降解、易通过食物链富集、危害大的化学物质。除了对其致癌致畸致突变等作用的研究外,如何评价水中有机物混合污染对人体的危害是研究者们目前面临的难题。对水中有机物的检测发现,邻苯二甲酸酯类和多环芳烃类是污染最为广泛的两类化合物,其中邻苯二甲酸酯类的邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)污染最为严重,而多环芳烃类的苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]为该类化合物中毒性最强。本研究选用DBP和BaP作为有机污染物的代表,观察其单独和联合作用于体外培养的大鼠睾丸支持细胞后的毒性效应,以期为建立评价有机物混合污染对人体健康危害的体外检测方法提供实验依据。一、体外培养大鼠睾丸支持细胞模型的建立选用出生后18-21天的雄性SD大鼠,采用直接二步酶消化法与低渗处理纯化法相结合,并使用低速离心与二次贴壁的方法,制备睾丸大鼠支持细胞。在细胞分离后的48h,用20mmol/L Tris-HCl处理生精细胞,并于细胞融合80%后消化传代,用油红O、碱性磷酸酶染色,并通过透射电镜和HE染色观察以及支持细胞特异性表达抗原FasL免疫组化鉴别分离的支持细胞纯度。染色后镜下可见细胞边缘不清,胞体呈宽大的柱状或不规则状,有粗大的突起,细胞质内可见小吞噬物或小空泡,核大呈蓝色,卵圆形或不规则形,核质均匀,多于95%的细胞胞质中有大小不等的红色脂滴,此为支持细胞的特异性标志之一,生精细胞与间质细胞均不着红色。被碱性磷酸酶染色的生精细胞和管周肌样细胞少于1%,透射电镜可观察到支持细胞的特异性结构-卫星小体,而分离培养的绝大部分细胞都能表达特异性标志其功能活性的FasL。通过对其生长曲线的检测,确定分离后5-9天为其对数生长期,适合采用此期的支持细胞进行毒理学实验。至此,成功建立体外培养大鼠睾丸支持细胞模型。二、DBP和BaP分别及联合染毒对大鼠睾丸支持细胞的毒作用1.共设立15个试验组和2个对照组在2个染毒时间点开展MTT实验及细胞计数,即以DMSO为溶剂的0.1、1、10、100、500μg/mlDBP各组和0.01、0.1、1、10、50μg/ml BaP各组以及DBP+BaP联合染毒(按剂量从低到高依次对应联合)、DMSO组和空白对照组。实验结果显示,DBP在一定的剂量下(500μg/ml,12h)可以刺激支持细胞增殖,随着染毒时间的增加高剂量刺激增殖作用消失,而较低剂量(100μg/ml,24h)出现刺激增殖的作用。BaP在24h内不影响支持细胞的生长,二者联合染毒呈现出与DBP的刺激增殖相似的作用,但高剂量联合染毒反而抑制细胞的增殖。细胞计数结果与此一致。据此选择1、10、100μg/mlDBP各组和0.1、1、10μg/mlBaP各组以及DBP+BaP联合染毒(按剂量从低到高依次对应联合)开展所有后续实验。2.培养液中乳酸含量的高低可以反映支持细胞的功能。用选定剂量染毒支持细胞后在12、24、48h三个时间点检测培养液中的乳酸。DBP在高剂量下(100μg/ml)可以刺激支持细胞乳酸的分泌,而BaP在短时间内(12h)抑制乳酸的分泌,而随着时间的延长(48h)可显著刺激乳酸分泌。二者联合染毒在12h和24h内只有高剂量组(100μg/ml DBP+10μg/ml BaP)刺激乳酸分泌,染毒延长至48h后各组均能刺激乳酸分泌。3.波形蛋白是细胞骨架中一种重要中间纤维,在细胞形态维持、细胞运动、细胞信号转导和细胞凋亡等方面起着重要作用。支持细胞染毒12h后,各染毒组均不引起波形蛋白的表达变化;24h后,10μg/mlDBP与1μg/mlBaP可诱导波形蛋白表达下降(p<0.05),100μg/mlDBP组和10μg/mlBaP组的波形蛋白下降更为显著(p<0.01),高剂量联合染毒组(100μg/ml DBP+10μg/ml BaP)波形蛋白的表达出现显著降低。染毒48h后,DBP和BaP单独染毒中、高剂量组与DMSO组相差显著(分别为P<0.05和P<0.01),联合染毒各组的波形蛋白表达均显著减少,该结果提示DBP与BaP单独染毒均可降低支持细胞波形蛋白的表达,而且呈剂量依赖关系,二者联合呈现轻度相加作用。高剂量组染毒后细胞波形蛋白形状发生变化,从多变形收缩成索状或圆形,细胞间的空隙明显增大。4.微管蛋白是一种具有多种功能的细胞骨架蛋白,对微管蛋白的损伤将影响生精上皮的结构和支持细胞对生精细胞的支持作用。各染毒组12h后细胞内的α-tubulin蛋白的表达未见改变;染毒24h后,BaP高剂量组α-tubulin蛋白表达明显增加(P<0.05);48h后,DBP高剂量组的α-tubulin蛋白表达显著上升(P<0.05),BaP低剂量组和中剂量组与DMSO组相比α-tubulin表达增加(P<0.05),高剂量组增加的幅度更大(P<0.01)。令人感兴趣的是联合染毒各组并没有出现显著变化,说明二者的联合作用对支持细胞α-tubulin的影响要小于二者单独染毒。该结果提示DBP和BaP均可以干扰支持细胞的微管蛋白,BaP的强度大于DBP,但是二者联合染毒后该干扰作用消失,呈现拮抗效应。5.支持细胞分泌的抑制素(inhibin, INH)和转铁蛋白(transffen,Tf)在生精过程的调节中具有重要作用。DBP染毒12h以后并不影响INH B和Tf mRNA表达;24h后,三个剂量组均刺激INH B的表达,而仅高剂量组刺激Tf表达。但48h后,均显著抑制INH B和Tf mRNA的表达,具有剂量依赖关系。BaP染毒12h后,中、高剂量组INH B的表达均显著下降,呈剂量依赖关系,而对Tf的表达无影响;24h后,高剂量组延续对INH B的抑制,而三个组均可刺激Tf的表达;染毒时间延长至48h后,BaP三个组对INH B和Tf均有显著抑制作用。DBP和BaP联合后二者对INH B的影响表现为拮抗效应,而对Tf的作用与单独作用相一致。三、DBP和BaP分别及联合染毒对大鼠睾丸支持细胞MAPK途径的影响采用功能基因芯片检测10μg/ml DBP、1μg/ml BaP和二者联合染毒组MAPK途径相关基因的变化,并用Western blot检测全部9个染毒组及DMSO组的ERK、JNK和P38及各自磷酸化水平的变化。结果如下:1. 10μg/ml DBP染毒后Egr1、c-fos、Ksr1、HPK1、Jnk3、ERK1、NFAT3、RPLP1这8个基因与对照组比显著下调,而p38δ显著上调。该结果提示,DBP染毒后对MAPK的三条通路:ERK1/2、JNK/SAPK、P38MAPK均有影响,除此之外还可改变早期的反应基因以及HPK1、Ksr1等MAPK通路上游分子的表达。用western blot检测蛋白表达显示,DBP染毒后各组总ERK的变化不显著,该结果与erk基因显著下调不一致,p-ERK的表达各实验组增加,呈剂量反应关系;各组JNK/SAPK总蛋白和磷酸化的JNK1/2的表达明显下降,且呈剂量反应关系;从10μg/mlDBP开始诱导P38表达增加,呈剂量反应关系,但各组磷酸化水平并没有显著差异。2. 1μg/ml BaP染毒后,MAPK通路仅有Jnk3一个基因显著下调。蛋白检测发现,总ERK未见显著变化,而p-ERK的表达各组均有增加;JNK/SAPK总蛋白的表达各组略有降低,而p-JNK各组均下降,呈剂量反应关系;BaP各组对支持细胞P38的表达无影响。3. DBP+BaP联合染毒后,与DMSO组相比仅4个基因发生变化:Cyclin D2和p38δ显著上调,而Egr1和c-fos显著下调,该结果表明联合染毒对MAPK途径的影响要小于DBP单独染毒。而联合染毒组和DBP组相比,Cyclin D2、Ksr1、ERK1、NFAT3、RPLP1和Mknk1共7个基因上调,该结果提示,加入BaP后,DBP单独染毒使支持细胞发生的基因表达变化得到修正,这上调的7个基因在DBP单独染毒时均下调,二者联合呈现拮抗效应,这与第二部分实验中多项指标显示DBP与BaP联合染毒后出现拮抗效应相一致。蛋白结果显示,联合染毒各组总ERK未见显著变化,而p-ERK的表达较DBP染毒组高;联合染毒的高剂量组JNK/SAPK总蛋白的表达与对照比下降,而p-JNK表达量反而高于各单独染毒组;总P38的变化趋势与DBP各组相似,随着染毒剂量的升高而表达增加,但各组磷酸化水平并没有显著差异。总之,一定剂量的DBP可以刺激睾丸支持细胞的增殖,DBP和BaP均可以刺激乳酸的分泌(BaP为先抑制后刺激),二者均可降低波形蛋白和增加微管蛋白α的表达,对INH B和Tf的作用表现为先刺激后抑制。DBP可刺激支持细胞MAPK通路的三条主要途径发生变化,而BaP只干扰其中的两条途径即ERK与JNK/SAPK途径,并不影响P38途径。在本实验观察的大部分指标中,二者联合染毒可产生拮抗效应,有的作用趋势与DBP一致,但个别指标还显示出轻度的相加作用,DBP和BaP联合染毒后的毒性作用是一个综合复杂的过程,其机制还需要进一步深入研究。