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目的:脓毒症心功能障碍(septiccardiomyopathy)是脓毒症和脓毒性休克的常见并发症。线粒体损伤被认为是其主要发病机制之一。心脏是一个持续供能器官,需要大量的ATP来维持收缩和舒张功能。线粒体是产生ATP的主要细胞器,约占心肌体积的三分之一。如果受损,会对心肌能量供应和心功能造成损害。此外,受损的线粒体可产生更多活性氧(ROS)等毒物,对细胞和组织造成进一步损伤。过氧化物酶体增殖物受体γ辅激活因子1-α(PGC-1α)是维持机体多个器官能量平衡的重要转录蛋白。同时,它也是线粒体生物合成的关键调控基因,还可以通过TFEB(转录调节因子EB)影响溶酶体合成,进而影响心肌自噬功能。虽然PGC-1α已经作为一些疾病的潜在治疗靶点吸引了广泛关注,但在心血管疾病,尤其是脓毒症心功能障碍疾病中研究甚少。我们通过建立脓毒症心功能障碍模型,检测PGC-1α在心肌组织和心肌细胞中的动态变化,并给予干预治疗,明确PGC-1α在脓毒症心功能障碍疾病中的作用及可能机制,为脓毒症心功能障碍的治疗提供新的思路。方法:通过LPS静脉给药建立脓毒症心功能障碍大鼠模型,SPF级Wistar雄性大鼠采用随机分数法分为给药后3h、6h、12h三组,并于每个时间点设置相应的对照组,每组6只。股动脉及颈总动脉置管,多导电生理记录仪压力换能器监测平均动脉压(MAP)、左室舒张末压(LVEDP)、舒张期左室内压下降最大速率(-dp/dtmax)、收缩期左室内压上升最大速率( dp/dtmax)等指标。各组大鼠到达相应时间点,麻醉后取左心室肌。HE染色观察心肌组织损伤情况,透射电镜下观察心肌组织超微结构变化,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化,免疫组化及免疫荧光观察PGC-1α、mtTFA、LC3B及P62表达情况。RT-PCR检测PGC-1α、mtTFA、LC3B、P62、PINK1及Parkin的mRNA表达水平,Westernblot检测以上基因的蛋白表达水平。培养H9c2大鼠心肌细胞,利用CCK-8方法确定LPS最佳干预浓度为10μg/mL,干预时间为24h,构建细胞层面脓毒症心功能障碍模型。检测干预前后各组细胞PGC-1α表达情况,并应用PGC-1α小分子激动剂ZLN005干预细胞,ZLN005浓度为10μg/mL,分为对照组、LPS组和LPS ZLN005组,流式检测各组H9c2细胞凋亡情况,Westernblot检测PGC-1α蛋白变化,电镜观察各组细胞线粒体损伤情况。15mg/kgZLN005腹腔注射干预脓毒症心功能障碍大鼠模型,分为对照组、ZLN005组、LPS组和LPS ZLN005组,Westernblot检测PGC-1α蛋白变化,观察干预12h后各组大鼠心肌病理结构和电镜下微结构,Westernblot和免疫荧光检测各组心肌组织凋亡蛋白Bax及Bcl2表达情况,流式检测线粒体膜电位变化情况。通过慢病毒转染方法过表达H9c2细胞中PGC-1α基因,并利用嘌呤霉素筛选转染后细胞形成稳转细胞株,Westernblot和免疫荧光方法检测验证转染情况。转染成功后,分为对照组、LPS组和PGC-1α~ LPS组。流式细胞仪检测各组H9c2细胞凋亡情况,并通过检测H9c2细胞ATP水平、ROS水平、细胞色素C水平以及线粒体膜电位变化情况,评价各组细胞线粒体损伤情况。Westernblot及免疫荧光方法检测PGC-1α及下游蛋白mtTFA的表达变化,RT-PCR检测PGC-1α及mtTFA的mRNA表达水平以及各组细胞mtDNA拷贝数变化,进而评估线粒体生物合成激活情况;Westernblot及免疫荧光方法检测LC3B、P62、PINK1及Parkin蛋白表达变化,RT-PCR检测LC3B、P62、PINK1及Parkin的mRNA表达水平,进而评估各组心肌细胞自噬激活情况。结果:1、HE结果显示:LPS3h模型组心肌结构基本正常。LPS6h模型组出现心肌结构紊乱,肌纤维间距增宽,部分肌纤维断裂,可见少量炎性细胞浸润,给药12h时损伤更加明显。电镜下观察心肌微结构发现:LPS3h组心肌纤维结构基本正常,但部分线粒体已出现空泡变性和嵴断裂;LPS6h组肌丝部分扩张,Z线可见,但I带和A带界限不清。线粒体出现肿胀、外膜破坏、空泡变性和嵴断裂,线粒体数量有所减少。LPS12h组肌纤维排列异常紊乱,线粒体损伤严重,数量明显减少。线粒体膜电位(凋亡检测)结果显示:LPS3h组即有部分心肌细胞线粒体膜电位下降,随着时间进展,膜电位下降细胞数逐渐增多,且与各自对照组相比均有统计学差异,12小时为凋亡高峰。2、Westernblot及免疫荧光结果显示:LPS3h组心肌组织PGC-1α及下游蛋白mtTFA增加显著,但随时间进展,LPS6h和LPS12h组激活减弱;心肌组织自噬体合成蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ一直处于高表达,但P62及线粒体自噬关键蛋白PINK1和Parkin均未见明显改变。3、LPS干预H9c2心肌细胞24h后,PGC-1α表达水平明显下降。给予ZLN005药物干预后,PGC-1α表达水平升高,同时伴有细胞凋亡水平的改善;ZLN005干预脓毒症心功能障碍大鼠模型后12h,干预组心肌组织PGC-1α表达水平较LPS组明显升高,但两组间心肌组织大体及微结构改变未见明显差异,凋亡水平及线粒体膜电位下降情况均未见改善。4、慢病毒转染方法过表达H9c2心肌细胞PGC-1α后,可以显著改善LPS干预后的细胞凋亡水平。5、同LPS组相比,PGC-1α~ LPS组细胞线粒体ATP水平有所增高,但无统计学意义;PGC-1α~ LPS组ROS及胞浆细胞色素C水平均显著下降,线粒体膜电位明显改善。6、同LPS组相比,PGC-1α~ LPS组PGC-1α及mtTFA蛋白表达显著增加,mtDNA拷贝数明显增多;自噬蛋白LC3B表达未见明显增加,但P62表达显著降低;PINK1蛋白及mRNA表达均有所增加,但两组间比较未见统计学差异;各组间Parkin基因及相应蛋白比较均未见明显改变。结论:1、脓毒症心功能障碍模型中心肌组织存在细胞凋亡和线粒体损伤,且随时间进展逐渐加重。模型早期心肌组织中PGC-1α显著激活,但随疾病进展,激活减弱。2、小分子激动剂ZLN005能显著增加H9c2细胞中PGC-1α蛋白表达水平,且可以改善LPS干预后H9c2细胞凋亡水平;但在动物模型中效果不显著。3、过表达H9c2细胞PGC-1α后,可以改善LPS干预后H9c2细胞凋亡水平,与LPS组相比,PGC-1α~ LPS组细胞线粒体功能明显改善,损伤程度减轻,ATP合成有所增加。4、与LPS组细胞相比,PGC-1α~ LPS组细胞线粒体合成增加,线粒体DNA拷贝数量增多,且自噬流明显改善。这可能是其减轻LPS诱导的心肌细胞线粒体损伤,进而改善细胞凋亡的潜在主要机制。