为了实现柑橘无核育种目标,将带CMS特性的愈伤原生质体与有籽品种的叶肉原生质体融合,实现CMS性状的转移,创制同时具有叶肉亲本的优良性状和愈伤组织亲本无籽特性的体细胞杂种/胞质杂种。本研究有针对性地选择温州蜜柑作为悬浮系原生质体亲本与以多籽或有籽柑橘品种的叶肉原生质融合,试图通过对称融合方式获得转移温州蜜柑不育胞质的体细胞杂种;同时,充分利用本实验室已有的细胞学技术观察原生质体融合过程中细胞器的形态、数量和位置变化,特别是线粒体在原生质体融合及细胞再生过程中的动态变化。主要结果如下:1.‘国庆1号’温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1,G1)为愈伤悬浮系亲本,分别与‘Nova’橘柚[C.reticulata Blanco×(C.reticulata Blanco×C.paradisi Macf.)]和红暗柳橙(C.sinensis Osbeck cv.Red Anliu)叶肉原生质体融合,获得了G1+‘Nova’橘柚和G1+红暗柳橙两个组合的再生植株。G1+‘Nova’橘柚组合得到6棵再生植株,流式细胞仪检测所有再生植株均为四倍体,分子标记检测再生植株具有双亲的核基因组。其中1、3和6号植株叶绿体基因组来自愈伤亲本G1,2、4和5号植株的叶绿体基因组来自其叶肉亲本。G1+红暗柳橙组合获得8棵再生植株,选取其中4棵进行倍性分析和分子鉴定,流式细胞仪倍性检测显示1-3号为四倍体植株,4号为二倍体植株;分子标记分析表明所有四倍体植株均包含双亲的核SSR特征带,细胞质基因组均来自愈伤组织亲本,为异源体细胞杂种;二倍体植株的细胞核基因组与愈伤组织亲本一致,为愈伤亲本的再生植株。2.明场下对线粒体和叶绿体在融合过程中的动态变化进行观察,发现在细胞融合过程结束后,两者不能立即完成融合,随着培养时间的增加,各种细胞器无法分辨。利用荧光标记和荧光染料技术对融合子持续观察,初步了解了融合过程中细胞器的形态变化过程。融合细胞中的叶绿体在培养7d后明显减少,10d后几乎完全消失,无法直接遗传给子细胞,这个现象可能与叶肉原生质体无法再生有关。内质网在7d左右恢复网状结构。在培养16d的再生细胞团中,内质网聚集于细胞壁。不同来源细胞中线粒体数量、形态和位置都有很大差异:叶肉原生质体线粒体数量少,体积较大,基本位于叶绿体周围;愈伤组织原生质体线粒体数量多,体积较小,位于细胞膜和淀粉粒周围。线粒体融合与分裂在细胞融合后即开始发生,16h后几乎90%以上线粒体完成遗传物质的交换。