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日本脑炎病毒(简称乙脑)属于黄病毒科黄病毒属,是一种以蚊虫为媒介传播的人畜共患的病毒性疾病。对人类危害巨大,是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对猪可引起繁殖障碍,给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主,带毒猪是本病的主要传染源。因此,控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前用于猪的乙脑疫苗包括弱毒苗和灭活苗,但是有关它们的安全性,生产和使用费用等问题越来越突出。WHO正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗,乙脑病毒的E蛋白与病毒和细胞受体结合,膜融合有关,也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,又称抗原决定簇(antigenic determinant)。它是T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor, BCR)与抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中,TCR和BCR所识别的抗原表位不同,分别被称为T细胞表位和B细胞表位。作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高度特异性的体液及细胞免疫反应,从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。本研究利用基因重组技术,把日本脑炎病毒E蛋白上6个主要的B细胞表位,一个CTL表位和一个Th表位基因串联起来,构建入原核表达载体,在E. coliBL21中表达。表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠研究其免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的乙脑病毒多表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下：1、日本脑炎病毒E蛋白多表位基因的设计及在大肠杆菌中的融合表达根据文献报道及多表位疫苗的构建策略,本文选择了E蛋白上6个能诱导机体产生中和抗体的B细胞表位,氨基酸残基分别位于75-92,149-163,258-285,356-362,373-399,397-403。以及一个CTL表位和一个Th表位,氨基酸残基分别位于60-68和436-445。各表位间用甘氨酸和丝氨酸分开,使各表位相对独立并有利于抗原的递呈。根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则,设计合成10条引物,采用重叠延伸PCR (SOE)合成JEV E蛋白的多表位基因(命名为MEP),将其克隆到pMD18-T载体,经测序分析正确后,用EcoRI和XhoI双酶切连接到表达载体pET-28a(+)中,构建出重组表达质粒pET-MEP。将其转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和超声波裂解菌体后,运用SDS-PAGE进行可溶性分析,然后以His-Bind螯合层析柱纯化融合蛋白(命名为rMEP),利用Western Blotting对该融合蛋白进行了鉴定。结果表明：重组融合蛋白rMEP以包涵体的形式获得了高效表达。通过His·Bind螯合层析柱纯化后的融合蛋白rMEP,经SDS-PAGE和薄层扫描分析获得了较好的纯化,其纯度达到了97.2%；且通过Western Blotting鉴定其具有良好的抗原性。2、日本脑炎病毒E蛋白多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性和保护效力研究4～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。将rMEP、EDⅢ蛋白、E蛋白和灭活苗分别以腹腔接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设对照组,用PBS免疫。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体、细胞因子(IL-4, IL-2和IFN-y)和CTL,并做了攻毒保护试验来衡量rMEP的免疫效果。结果表明,rMEP既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,且体液免疫和细胞免疫的水平均比EDIII蛋白和E蛋白高。抗体亚型分析结果表明,rMEP既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2的分泌,但以IgG1为主；同时细胞因子检测结果进一步表明rMEP主要诱导Th2型细胞因子(IL-4)的产生,因此说明rMEP主要诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明rMEP与灭活苗一样都能保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染。综上所述,构建的乙脑病毒E蛋白多表位基因疫苗能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,对致死量的乙脑病毒感染具有保护作用,从而为研究安全有效的乙脑疫苗提供了新的思路和方法。