背景： 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率高居恶性肿瘤的第二位，是目前发病率高、治疗困难、预后极差的恶性肿瘤，目前我国每年约有10万新诊断的肝癌患者，另每年约有12万人死于肝癌，占全球肝癌死亡数的45％。由于肝癌起病隐匿，绝大多数的肝癌发现时已是晚期而无法手术，临床上肝癌的手术切除率仅为20％。近年来随着肝癌介入化疗的普遍开展，中晚期的肝癌患者的5年生存率有了明显的提高。肝癌介入治疗所使用的化疗药物大都具有明显的毒副作用，在作用于肿瘤组织的同时，会损伤正常的组织器官，从而造成患者肝功能、肾功能等损害，甚至危及患者生命。寻找新的高效低毒的药物并应用于肝癌的化疗，已是摆在我国和全世界医药工作者面前的急需解决的一道难题维生素是一类临床上应用广泛的药物，价格低廉。已有研究表明，维生素B6、C、K3均有抑制多种肿瘤细胞生长的作用，对正常细胞几乎无毒副作用，维生素B6可直接损伤肿瘤细胞使其坏死，维生素C、K3单药使用可诱导肿瘤细胞凋亡，维生素C与K3联用则会发生另外一种死亡方式，即“胞质自切”现象，这些现象背后的分子机制有待进一步的研究。 目的： 1.观察维生素B6、C、K3单独及联合作用对人肝癌HepG2细胞的生长抑制作用，从而明确三种维生素的药物效果。 2.从形态学上、基因表达改变上分辨凋亡与胞质自切的差异，进一步认识胞质自切的本质。 3.检测三种维生素对细胞周期及AFP含量、γ-GT活性的影响，为三种维生素应用于肝癌治疗提供理论依据。 方法： 1.人类肝癌细胞株HepG2的维持培养及扩大培养：用台盼蓝染色后检测HepG2细胞活率，并选择细胞活率在95％以上进行传代培养； 2.光镜及瑞氏染色下观察B6、C、K3单独及联合作用对HepG2细胞形态学的改变；MTT法检测各组细胞增殖抑制率差异，并选择合适的药物浓度和药物作用时间进行下一步实验。 3.流式细胞术检测B6、C、K3单独及联合作用于HepG2细胞后细胞周期的变化。 4.放射免疫法测定分泌型AFP含量，化学比色法测定胞浆γ-GT活性。 5.RT-PCR法检测B6、C、K3作用后细胞P53、BCL-2、PTEN、VEGF、MMP-2mRNA水平的表达。 结果： 1.肝癌细胞生长良好，呈贴壁生长，多为长梭形，生长迅速，细胞生长密集时可多层重叠生长。 2.维生素B6、C、K3抑制HepG2细胞增殖，其抑制效应与药物浓度、作用时间有关；形态学改变上，呈现三种死亡方式，B6组表现为细胞坏死，高浓度C组和K3组表现为细胞调亡，CK3联用组则表现胞质自切的形态学改变；B6与C或K3联用对细胞增殖抑制有协同作用。 2.流式细胞术检测发现，CK3联用组和B6CK3联用组的Gl峰前出现亚二倍体峰，另外，B6、C、K3单独及联用组的Gl期细胞比例增加，S期细胞减少，细胞被阻滞于Gl期，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.维生素B6、C、K3作用后HepG2肝癌细胞后分泌型AFP含量减少、除VC组外，其他各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，γ-GT活性下降，除K3组外，其余各组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。 4.RT-PCR法检测发现，维生素C和K3可引起HepG2细胞P53mRNA表达升高，BCL-2，VEGF、MMP-2表达下降，呈剂量依赖性，CK3联用组和B6CK3可使VEGF、MMP-2表达明显下降，P53和PTENmRNA表达变化不明显。 结论： 1.维生素B6、C、K3可抑制HepG2细胞增殖，呈剂量依赖性和时间依赖性。C和K3联用可明显加强抑制，B6与C、K3联用时，有协同抑制作用。 2.形态学分析，B6直接损伤细胞导致细胞坏死，大剂量C、K3可诱导HepG2细胞凋亡，而CK3联合组可使HepG2发生“胞质自切”现象，进而导致细胞死亡。“胞质自切”对肿瘤细胞的抑制效果明显。胞质自切不伴有凋亡基因表达改变，但伴有肿瘤转移相关基因改变。 3.AFP和γ-GT是公认的反应人肝癌细胞的增殖标志，是观察药物逆转肝癌恶性表型的检测指标，维生素B6、C、K3在抑制细胞增殖同时直接影响AFP分泌和γ-GT的活性，提示其具有逆转肝癌恶性表型的作用，值得进一步探讨。