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耐高温α-淀粉酶,能在高温条件下水解淀粉,是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于发酵、制糖等工业。高嗜热古细菌Pyrococcus furiosus 产生的胞外α-淀粉酶(PFA)具有优越的耐热性能,较低的最适pH,活性不依赖于钙离子,因此,潜在的应用价值很大。本文主要研究PFA 在真细菌中的分泌表达和在真核生物中的表达,并构建了细菌表达载体以用于上述工作。用PCR 方法从P. furiosus 染色体DNA 中扩增出含信号肽序列的PFA 结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a 中,构建成重组质粒pET-PFA(s+)。以pET-PFA(s+)为底物,扩增出不含信号肽的PFA 结构基因,插入pET28a。两种重组载体分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)。在转化子中,两种结构基因与pET28a 携带的His-tag 融合表达。质粒pET-PFA(s-)的融合表达产物不含信号肽,重组菌在IPTG 诱导下表达出有活性的重组酶。质粒pET-PFA(s+)的表达产物含信号肽,其转化子不能表达出有活性的产物,说明含信号肽的重组酶如果由于融合表达而不能被切除信号肽,则无法形成有活性的结构。质粒pET-PFA(s-)转化子表达的重组酶活力达11.4 U/mL,但大部分的酶活在离心后与细胞碎片一起沉淀。重组酶的最适温度为95℃,最适pH 为5.0,在121℃热处理活性半衰期超过30 min。将表达载体pKK223-3的tac启动子插入载体pET28a多克隆位点,构建成表达载体pEtac。新载体pEtac 为非融合型表达载体,表达产物氨基酸序列与插入基因编码的蛋白完全一致,同时载体自身含lacI 基因能高表达乳糖操纵子阻遏蛋白,因此本底转录低于pKK223-3。将含信号肽的PFA 结构基因插入pEtac 中,构建成重组质粒pEtac-PFA,成功转化大肠杆菌JM109。重组菌在IPTG 诱导下表达出PFA 活性,其中溶解在周质中的酶活达1.4 U/mL,说明PFA 能