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随着人类基因组计划的逐步完成,科学家们又进一步提出了后基因组计划,蛋白质组(proteome)研究则是其中一个很重要的内容。蛋白质间相互作用是细胞生命活动的基础和特征,蛋白质相互作用连锁图属于蛋白质组学的研究范畴,且相应的工作也已经展开。
本实验室利用改进的高通量酵母双杂交技术平台来研究人肝脏重要蛋白质的相互作用,用432个诱饵筛选正常成人肝脏cDNA文库,其中159个诱饵得到的472对相互作用已得到初步验证。
本文设计从上述159个诱饵中随机选取60个,利用经典的酵母双杂交系统从人类肝脏cDNA文库筛选相互作用的蛋白质,并与已有的结果进行互补,期望更真实地获得相互作用信息。本文的主要内容有:
1.以Bsu36I克隆方式构建432个诱饵表达载体以及用无酶克隆方式构建了3309个猎物表达质粒。由于引入的GFP作为反选择标记,且载体本身自联背景低,因此用无酶克隆快速的构建了近4000个猎物表达质粒。
2.用60个诱饵从3309个猎物表达质粒混合而成的人类肝脏ORF有限文库钓取相互作用的蛋白质,已经初步完成筛选,得到1668个准阳性克隆;其中有1326个准阳性克隆通过了营养缺陷筛选;其余报告基因表达的检测及其他下续步骤正在进行。
本研究使用的克隆方式及改良酵母双杂交技术适用于规模化地克隆基因和获取新的相互作用信息,在蛋白质组学的高通量操作中有广泛的应用前景。