研究目的：　　通过microRNA mciroarray芯片技术确定与肝移植术后急性排斥反应相关的miRNA表达谱，利用生物信息学技术从中筛选出表达差异显著的特定miRNA，作为肝移植术后急性排斥反应的生物学标志物。　　研究方法：　　1、ROLT建模训练及改良　　以Kamada提出的“双袖套”法为基础，结合改良方法，选用Wistar或SD大鼠进行ROLT建模基本技能训练，直至能为下一步研究提供可靠、稳定的ROLT模型。　　2、建立同种异基因大鼠肝移植急性排斥反应模型　　以Lewis及BN大鼠作为供、受体，将实验分作排斥组（Lewis/BN）和无排斥组(Lewis/Lewis)。ROLT术后第3d、5d、7d随机处死3只受体后收集外周血、移植肝，比较2组在术后不同时间肝功能指标(ALT、TBIL)的动态变化以及病理改变（排斥反应指数，即rejcetion actionindex，RAI）。　　3、microRNA microarray芯片技术　　采集排斥组(Lewis/BN)和无排斥组(Lewis/Lewis)ROLT术后第7d的外周血标本，运用microRNA microarray分析其miRNA表达谱，采用生物信息学技术从中筛选出具有急性排斥反应诊断意义的特定miRNA，作为ROLT急性排斥反应的生物学标志物。　　4、实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)　　收集排斥组和无排斥组ROLT术后3d、5d、7d的外周血、移植肝，用qRT-PCR技术定量分析特定miRNA的表达量，并与RAI评分、肝功能变化进行相关性分析，确定与ROLT急性排斥反应的关系。　　5、特定miRNA靶基因预测及验证　　通过PicTar、TargetScan和miRanda等三种在线miRNAs靶基因预测软件，预测特定miRNA的下游靶基因。采用双荧光素酶报告基因系统对特定miRNA的靶基因进行验证。　　6、混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)和流式细胞技术(flow cytometry，FCM)　　用丝裂霉素C灭活的Lewis大鼠脾淋巴细胞作为刺激细胞，并设4组反应细胞中，分别为A组:BN大鼠脾淋巴细胞，B组:Lewis大鼠脾淋巴细胞，C组:在A组中加入特定miRNA的inhibitor，D组:在B组中加入特定miRNA的mimics。4组均采用在连续增殖的细胞中荧光强度具有隔代二倍递减的特征的CFSE标记CD3+细胞，利用流式细胞术观察MLC中T淋巴细胞增殖的情况。　　7、检测肝移植术后稳定生存者与急性排斥反应患者PBMCs中差异表达miRNA　　纳入肝移植术后稳定存活患者29例（STA组），反复排斥反应者10例(RJ组)，健康对照者17例（HC组），利用芯片检测各组PBMCs中microRNAs的表达谱，并用Real-time PCR对差异表达的microRNAs进行验证。　　研究结果：　　1.ROLT建模达到成活率高、重复性好的要求。　　ROLT建模成功关键因素:(1)肝上下腔静脉的吻合是大鼠原位肝移植建模过程中的关键步骤和难点;(2)获取高质量的的供肝，是决定ROLT成功与否的重要因素;(3)麻醉意外是ROLT术中常见的死亡原因，乙醚吸入麻醉是安全、可靠、可控性非常好的麻醉方法;(4)熟练的套管技术是缩短无肝期的保证;(5)术后给予抗感染、补液等围手术期处理，利于提高ROLT成功率。　　2.成功的建立同种异基因大鼠原位肝移植(Lewis-BN)急性排斥反应模型。　　2.1病理检查RAI评分　　在排斥组中，术后第3d、5d、7d，RAI评分进行性升高，且有统计学意义(P=0.026)，表明AR程度逐渐加重。无排斥组中，术后3个时间所评估RAI无显著差异(P=0.513)，均无典型AR的表现。各时间点的横向比较。术后第3d，排斥组与无排斥组RAI评分无显著差异(P=0.179)，表明未发生AR或AR尚不典型;术后第5d开始，至第7d，两组组之间RAI评分出现差异，其差异有统计学意义（P均小于0.05）;排斥组第5d出现轻到中度AR，第7d已然达到重度AR标准;无排斥组未发生AR。　　2.2肝功能指标(ALT、TBIL)　　排斥组和无排斥组在术后第3d、5d查血ALT、TBIL，均较术前显著升高，但两组间差异无统计学意义（P值均大于0.05）;直至术后第7天，3组间ALT、TBIL开始出现显著差异(P＜0.05)。　　2.3病理检查与肝功能的相关性分析　　RAI评分与ALT、TBIL呈中等程度的显著正相关（相关系数Rs分别为0.634、0.524，P均小于0.05），表明急性排斥反应越明显，肝功能损伤越严重。　　排斥组中的BN大鼠在术后第3天出现精神萎靡、进食饮水量下降、尿色加深发黄、反应迟钝;ALT和TBIL轻度升高;光镜下汇管区可见混合性炎细胞浸润和静脉内皮炎，伴部分肝实质变性，RAI为2～3分。随着时问的延长，急性排斥反应逐步出现并加重，至术后第5天，出现体重减轻、毛发蓬乱脱落、活动减少。术后第7天，急性排斥反应达高峰，TBIL上升至50～60mmol/L、ALT上升至800～1100U/L，病理上出现汇管区结构明显破坏，肝小叶消失，大量淋巴细胞和单核细胞浸润，明显的静脉内皮炎，小胆管增生，肝实质桥接坏死，RAI达7～9分。行Spearman相关分析也RAI评分与ALT、TBIL呈正相关，有统计学意义(P＜0.05)，表明急性排斥反应越明显，肝功能损伤越严重。　　本研究中，同种异基因(Lewis-BN)ROLT术后第5d开始出现轻到中度AR的病理学改变，而外周血肝功能指标直到术后第7d才出现与无排斥组相比显著的差异。　　3、microRNA microarray分析结果　　通过microRNA microarray芯片技术确定大鼠肝移植急性排斥反应相关的miRNA表达谱，采用生物信息学方法分析，结果，发现排斥组(Lewis/BN)相对无排斥组(Lewis/Lewis)micro RNA表达差异|Fold Change|＞l.5且P＜0.05的miRNA中，表达上调的有9个micro RNA(miR-24、miR-337、miR-118、miR-505、miR-135a、miR-206、miR-6322、miR-410、miR-877)，表达下调的有6个（miR-466c、miR-34c、miR-874、miR-466b、miR-3591、miR-434）。其中miR-206在排斥组的表达超过无排斥组4倍，差异最为显著，因此miR-206被确定为下一步研究的对象。　　4.miR-206的qRT-PCR分析结果　　收集排斥组、无排斥组在术后3d、5d、7d的外周血、移植肝，采用qRT-PCR技术进行检测其中miR-206表达量，所得Ct值经2-△△α法转换后进行分析。在外周血及移植肝中，两组miR-206的表达量在第3d就已经开始出现显著性差异。　　4.3miR-206表达与病理检查、肝功能化验的相关性分析　　外周血、移植肝中miR-206的表达两者之间呈显著正相关（Pearson检验），相关系数R为0.923且有统计学意义(P＜0.001)。外周血、移植肝中miR-206的表达和病理学检查RAI评分，通过相关分析（Spearman检验）表明两者和RAI之间均为显著正相关，相关系数分别为0.868及0.873且有统计学意义(P＜0.001)。miR-206与肝功能指标ALT、TBIL之间亦呈正相关（Pearson检验）。表明miR-206表达变化与发生急性排斥反应密切相关。　　5.miR-206靶基因的预测及验证　　通过PicTar、TargetScan和miRanda等三种在线miRNAs靶基因预测软件均预测FOXP1是miR-206是的靶基因之一。双荧光素酶报告基因系统证实FOXP1mRNA上有三个位点（位点830-836，位点892-898，位点3633-3639）能与miR-206有效结合，从而证实FOXP1是miR-206的靶基因之一。　　研究结论：　　1、采用同种异基因的近交系Lewis/BN大鼠作供受体组合，可以成功的建立起可靠的、移植急性排斥反应模型。　　2、micro RNA microarray技术结合生物信息学技术，筛选ROLT术后急性排斥反应有差异表达的miRNAs，其中miR-206表达差异最为显著。　　3、在同种异基因大鼠肝移植的急性排斥反应中，miR-206较肝功能化验指标、病理检查更早出现差异表达，而且增幅更大，有可能成为急性排斥反应的诊断、预测过程中更为早期、灵敏、可靠的生物学标志物。　　4、miR--206的靶基因是FOXP1，miR-206有可能刺激T淋巴细胞增殖。　　5、肝移植患者外周血miR-106b、miR-18b、miR-340可作为肝移植术后潜在标志物。