牙周炎是引起成人失牙的首要原因,革兰氏阴性专性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)是其主要病原菌,在牙周病灶中有较高的检出率。该菌可以产生脂多糖、胶原酶、牙龈素、菌毛等一系列毒力因子,诱导分泌多种炎症细胞因子,造成牙周支持组织的破坏。牙周炎症反应时,还伴随大量活性氧等自由基的产生,破坏机体氧化-抗氧化的平衡状态。因此,如何有效清除多余自由基,减少牙周组织损伤,已经逐渐成为防治牙周炎症反应的新焦点。目前,探寻具有治疗作用的天然药物越来越引起大家的关注。已有研究证实绿茶、咖啡、葡萄等多种天然多酚植物能够抑制牙龈卟啉单胞菌生长,减少牙周炎症因子的分泌。桂花性温味辛,是一种天然药材,对口腔炎,牙周炎有一定疗效。湖北咸宁是中国著名的“桂花之乡”,本实验拟利用区域优势、结合地方特色,制备桂花乙醇提取液,以人牙周膜细胞、牙龈卟啉单胞菌为研究对象,探讨桂花乙醇提取液的细胞毒性,对牙龈卟啉单胞菌增殖、胶原酶活性的影响以及提取液预处理对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的炎症因子、氧化应激标志物和细胞保护性酶表达水平的影响。第一章：桂花乙醇提取液的制备及对人牙周膜细胞的毒性作用制备桂花乙醇提取液,并体外分离培养人牙周膜细胞,用不同浓度的桂花乙醇提取液与人牙周膜细胞共培养,通过台盼蓝染色血细胞计数板计数法、罗氏细胞增殖试剂盒Ⅰ(MTT),观察和分析不同浓度桂花乙醇提取液对人牙周膜细胞的毒性作用。台盼蓝染色实验结果显示桂花乙醇提取液与人牙周膜细胞共培养72 h,各浓度组95%以上细胞有细胞活力。细胞增殖-活性检测(MTT)分析结果显示桂花乙醇提取液对人牙周膜细胞无明显的细胞毒性作用。提取液与细胞共培养72 h后,有97%以上细胞为活细胞。在实验结果中,浓度为31.25μg/mL的细胞相对增殖率为99.27±2.04%,浓度为62.5μg/mL的细胞相对增殖率为98.26±1.69%,浓度为125μg/mL的细胞相对增殖率为97.66±2.13%,浓度为250μg/mL的细胞相对增殖率为97.04±2.43%。不同浓度实验组与对照组两两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。桂花乙醇提取液、牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养72 h后,至少有75%以上细胞为活细胞。在实验结果中,浓度为31.25μg/mL的细胞相对增殖率为75.07±3.17%,浓度为62.5μg/mL的细胞相对增殖率为82.18±2.01%,浓度为125μg/mL的细胞相对增殖率为93.54±2.70%,浓度为250μg/mL的细胞相对增殖率为94.07±2.63%。由此可见,浓度为62.5、125及250μg/mL的桂花乙醇提取液能显著降低牙龈卟啉单胞菌酯多糖诱导的细胞毒性作用(P<0.05)。而桂花乙醇提取液的浓度需达到125μg/mL,才能完全消除脂多糖诱导的细胞毒性作用(P<0.05)。本部分实验结果如下：●成功制备了桂花乙醇提取液● 桂花乙醇提取液与人牙周膜细胞共培养72 h,细胞增殖率在97%以上,无细胞毒性作用。●桂花乙醇提取液能减少牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人牙周膜细胞的毒性作用。第二章桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌生长和胶原酶活性的影响本部分实验主要是体外培养牙龈卟啉单胞菌,与不同浓度的桂花乙醇提取液共培养,观察桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌生长增殖的影响；收集牙龈卟啉单胞菌上清液,体外观察不同浓度桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性的影响。微孔板稀释法结果显示桂花乙醇提取液明显抑制牙龈卟啉单胞菌的生长。在实验结果中,THB-HK培养基环境下,单纯牙龈卟啉单胞菌培养组的光密度值为0.82±0.005,31.25μg/mL桂花乙醇提取液与牙龈卟啉单胞菌共培养的光密度值为0.77±0.025,抑制率为5.74±3.11%；桂花乙醇提取液浓度为62.5μg/mL时,光密度值为0.59±0.017,抑制率为27.17±2.10%；浓度为125μg/mL时,光密度值为0.48±0.047,抑制率为41.42±5.76%；浓度为250μg/mL时,光密度值为0.20±0.007,抑制率为75.00±0.80%。提示当桂花乙醇提取液浓度≥62.5μg/mL时,能显著抑制牙龈卟啉单胞菌的生长(P<0.05)。在MBB-H培养基环境下,单纯牙龈卟啉单胞菌培养组的光密度值为0.67±0.016,31.2μg/mL桂花乙醇提取液与牙龈卟啉单胞菌共培养的光密度值为0.45±0.030,抑制率为32.79±4.48%；桂花乙醇提取液浓度为62.5μg/mL时,光密度值为0.37±0.046,抑制率为45.02±6.82%；浓度为125μg/mL时,光密度值为0.18±0.032,抑制率为72.86±4.79%；浓度为250μg/mL时,光密度值为0.10±0.006,抑制率为85.24±0.90%。提示当桂花乙醇提取液浓度≥31.25μg/mL时,能显著抑制牙龈卟啉单胞菌的生长(P<0.05)。由此可见,培养基的种类对提取液的抑菌作用有一定的影响。胶原酶活性检测实验结果显示桂花乙醇提取液能显著抑制牙龈卟啉单胞菌胶原酶的活性。在实验结果中,空白对照组的荧光值从开始至5h结束时分别为：1115±7.81、1147±7.37、1151±5.57、1153±6.24、1156±6.81、1158±6.00、1162±6.03、1165±7.09、1169±5.51、1173±5.57、1178±4.58；细菌对照组分别为：1173±5.57、1314±150.32、1494±16.37、1555±19.52、1595±23.59、1625±24.27、1646±24.95、1665±25.58、1678±24.44、1686±25.24、1700±26.51；抑制剂组分别为：1165±1.55、1227±21.28、1234±22.19、1243±21.66、1254±21.07、1257±20.52、1258±21.28、1259±21.94、1262±21.73、1266±22.14、1270.±22.61：250μg/mL桂花乙醇提取液组分别为：1148±2.52、1220.±3.51、1232±5.13、1246±5.69、1261±4.58、1268±7.55、1272±6.43、1277±7.09、1281±8.00、1285±8.62、1289±9.54；125μg/mL桂花乙醇提取液组分别为：1194±2.65、1293±1.73、1311±2.08、1334±2.08、1353±2.31、1365±2.00、1373±3.61、1379±3.51、1385±4.04、1393±5.69、1397±5.03；62.5μg/mL桂花乙醇提取液组分别为：1152±25.54、1287±22.01、1326±23.90、1351±28.51、1376±27.00、1389±26.51、1406±26.16、1417±26.63、1428±27.47、1436±26.85、1443±26.51；31.25μg/mL桂花乙醇提取液组分别为：1170±11.02、1367±26.31、1412±27.73、1451±30.04、1478±28.88、1494±27.15、1508±27.73、1518±26.00、1530±26.00、1538±26.00、1544±26.58。提示各组荧光值在早期呈快速增长,4h后趋于平衡。对于同一时间点,桂花乙醇提取液的浓度越高,其荧光值越低。我们选取5h这个时间点,计算不同浓度的桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性的影响。结果显示：提取液浓度为31.25μg/mL时,胶原酶活性率是70.24±5.09%,浓度为62.5μg/mL时,胶原酶活性率是50.77±5.08%,浓度为125μg/mL时,胶原酶活性率是42.01±0.96%,浓度为250μg/mL时,胶原酶活性率是21.26±1.83%。即31.25μg/mL浓度的提取液能抑制30%左右的牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性,62.5μg/mL浓度的提取液能抑制50%左右的牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性,125μg/mL浓度的提取液能抑制60%左右的牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性,250μg/mL浓度的提取液能抑制80%左右的牙龈卟啉单胞菌胶原酶活性。由此可见,桂花乙醇提取液能显著抑制牙龈卟啉单胞菌胶原酶的活性。本部分实验结果如下：●体外培养了牙龈卟啉单胞菌；●在THB-HK (富铁)培养基中,当提取液浓度≥62.5μg/mL时,与牙龈卟啉单胞菌共培养48 h能显著抑制细菌的生长。抑制率为27%左右至76%；●在MBB-H(缺铁)培养基中,当提取液浓度≥31.25μg/mL时,与牙龈卟啉单胞菌共培养48 h能显著抑制细菌的生长。抑制率为33%左右至85%；●桂花乙醇提取液能显著抑制牙龈卟啉单胞菌胶原酶的活性,抑制率为30%左右至80%左右。第三章桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导细胞分泌炎症因子的影响本部分实验主要是以体外培养的人牙周膜细胞为研究对象,使用牙龈卟啉单胞菌脂多糖作为诱导因子,探讨不同浓度桂花乙醇提取液预处理对脂多糖诱导的炎症因子IL-6,IL-8表达水平的影响作用。本实验采取ELISA法,借助成品试剂盒检测了细胞培养上清液中IL-6的浓度。结果显示细胞对照组IL-6的浓度为101.57±3.95pg/mL,脂多糖对照组IL-6的浓度为11444.93±76.36pg/mL,4个药物对照组(浓度从高到低)IL-6的浓度分别为23.17±0.97、42.13±7.33、61.20±9.20、102.47±16.62 pg/mLo4个实验组的IL-6的浓度分别为251.43±6.01、5373.17±180.95、11267.03±98.93、11525.37±82.49pg/mL。由此可见与细胞对照组相比,脂多糖对照组IL-6的浓度显著增高(P<0.05),说明牙龈卟啉单胞菌脂多糖能成功诱导人牙周膜细胞分泌IL-6,介导牙周炎症反应。与细胞对照组相比,4个药物对照组上清液IL-6的浓度均较低(3个浓度,P>0.05),说明单纯的桂花乙醇提取液与人牙周膜细胞共培养,对IL-6的分泌没有刺激诱导作用。与脂多糖对照组相比,只有提取液浓度为125μg/mL、250μg/mL的实验组IL-6的表达水平显著降低,说明当提取液浓度≥125μg/mL时,其预处理能有效抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的IL-6的分泌。但与细胞对照组相比,4个实验组IL-6的表达水平均显著增加,且随着提取液浓度的降低IL-6表达水平逐渐增加,说明桂花乙醇提取液预处理虽然在一定程度上能有效抑制脂多糖诱导的IL-6的分泌,但是仍然高于基线水平。同法,本实验也研究检测了细胞培养上清液中IL-8的浓度。结果显示细胞对照组IL-8的浓度为130.47±6.18 pg/mL,脂多糖对照组IL-8的浓度为6350.97±152.01 pg/mL,4个药物对照组(浓度从高到低)IL-8的浓度分别为40.80±0.87、72.10±1.49、91.03±3.73、111.00±2.36pg/mL。4个实验组的IL-8的浓度分别为241.67±12.16、2095.77±191.53、4352.07±99.41、6735.50±17.43pg/mL。由此可见与细胞对照组相比,脂多糖对照组IL-8的浓度显著增高(P<0.05),说明牙龈卟啉单胞菌脂多糖能成功诱导人牙周膜细胞分泌IL-8,介导牙周炎症反应。与细胞对照组相比,4个药物对照组上清液IL-8的浓度均较低(3个浓度P>0.05),说明单纯的桂花乙醇提取液与人牙周膜细胞共培养,对IL-8的分泌没有刺激诱导作用。与脂多糖对照组相比,只有提取液浓度为31.25μg/mL的实验组IL-8的表达水平没有显著差异(P>0.05),说明只要提取液浓度≥62.5μg/mL时,其预处理能有效抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的IL-8的分泌。但与细胞对照组相比,4个实验组IL-8的表达水平均显著增加,且随着提取液浓度的降低IL-8表达水平逐渐增加,说明桂花乙醇提取液预处理虽然在一定程度上能有效抑制脂多糖诱导的IL-8的分泌,但是仍然高于基线水平。第四章桂花乙醇提取液对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的氧化应激标记物的影响本部分实验主要以人牙周膜细胞为研究对象,借助成品试剂盒,探讨250μg/mL桂花乙醇提取液预处理对牙龈卟啉单胞菌诱导的总一氧化氮、丙二醛及超氧化物歧化酶含量的影响。实验结果显示细胞对照组总一氧化氮的含量为2.35±0.33μM/L,250μg/mL提取液对照组总一氧化氮的含量为2.15±0.27 μM/L,牙龈卟啉单胞菌脂多糖组总一氧化氮的含量为8.96±0.47μM/L,250μg/mL提取液预处理组总一氧化氮的含量为4.69±1.54 μM、L。与细胞对照组相比,250μg/mL提取液对照组总一氧化氮的含量没有差异性(P>0.05),脂多糖对照组的总一氧化氮含量则显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示脂多糖能刺激诱导人牙周膜细胞合成一氧化氮,提高细胞的亚硝基化水平。而250μg/mL提取液预处理组总一氧化氮含量明显低于脂多糖对照组,差异具有显著性(P<0.05),提示250μg/mL提取液预处理能减缓脂多糖诱导的总一氧化氮的合成。细胞对照组丙二醛的含量为0.87±0.19nmol/mgprot,250μg/mL提取液对照组丙二醛的含量为0.98±0.21 nmol/mgprot,牙龈卟啉单胞菌脂多糖组丙二醛的含量为3.12±0.30 nmol/mgprot,250μg/mL提取液预处理组丙二醛的含量为1.74±0.25 nmol/mgproto与细胞对照组相比,250μg/mL提取液对照组丙二醛的含量没有差异性(P>0.05),脂多糖对照组的丙二醛含量则显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示脂多糖能刺激诱导人牙周膜细胞合成丙二醛,提高细胞的氧化水平。而250μg/mL提取液预处理组总丙二醛含量明显低于脂多糖对照组,差异具有显著性(P<0.05),提示250μg/mL提取液预处理能减缓脂多糖诱导的丙二醛的合成。细胞对照组超氧化物歧化酶的含量为40.09±2.34 U/mgprot,250μg/mL提取液对照组超氧化物歧化酶的含量为42.27±2.57 U/mgprot,牙龈卟啉单胞菌脂多糖组超氧化物歧化酶的含量为22.89±1.98 U/mgprot,250μg/mL提取液预处理组超氧化物歧化酶的含量为35.58±1.67U/mgprot。与细胞对照组相比,250μ/mL提取液对照组超氧化物歧化酶的含量没有差异性(P>0.05),脂多糖对照组的超氧化物歧化酶含量则显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),提示脂多糖能抑制人牙周膜细胞合成超氧化物歧化酶,降低细胞的抗氧化水平。而250μg/mL提取液预处理组超氧化物歧化酶含量明显高于脂多糖对照组,差异具有显著性(P<0.05),提示250μg/mL提取液预处理能提高脂多糖抑制的超氧化物歧化酶的合成。实验结果如下：●牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使一氧化氮的含量从2.35±0.33 μM/L跃升至8.96±0.47μM/L。250μg/mL提取液预处理后总一氧化氮的含量恢复至4.69±0.54μM/L,显著降低了牙龈卟啉单胞菌脂多糖的诱导刺激作用。●牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使丙二醛的含量从0.87±0.19 nmol/mgprot跃升至3.12±0.30 nmol/mgprot。250μg/mL提取液预处理后丙二醛的含量恢复至1.74±0.25 nmol/mgprot,显著降低了牙龈卟啉单胞菌脂多糖的诱导刺激作用。● 牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使超氧化物歧化酶的含量从40.09±2.34 U/mgprot减少至22.89±1.98U/mgprot。250μg/mL提取液预处理后超氧化物歧化酶的含量恢复至35.58±1.67 U/mgprot,显著缓解了牙龈卟啉单胞菌脂多糖的抑制作用。第五章桂花乙醇提取液对牙周膜细胞细胞保护酶和Nrf2表达的影响本实验以人牙周膜细胞为研究对象,利用牙龈卟啉单胞菌脂多糖、桂花乙醇提取液进行干预,探讨提取液预处理对脂多糖诱导的Nrf2信号通路的影响。实验结果显示：将对照组即单纯人牙周膜细胞表达的HO-1量设置为1,则牙龈卟啉单胞菌脂多糖组表达的HO-1含量为1.33±0.07,250μg/mL桂花乙醇提取液组表达的HO-1含量为2.49±0.15,250μg/mL桂花乙醇提取液预处理2h再与牙龈卟啉单胞菌脂多糖、人牙周膜细胞共培养,HO-1的含量为3.14±0.20。由此可见,与单纯细胞培养组相比,脂多糖、提取液单独与人牙周膜细胞共培养都能增加细胞保护性酶HO-1的表达(P<0.05),且脂多糖组与提取液组相比,提取液能诱导人牙周膜细胞产生更多的细胞保护性酶HO-1(P<0.05)。提取液预处理使得脂多糖诱导的HO-1合成量表达更高,说明提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞抵抗脂多糖带来的毒性损伤。桂花乙醇提取液预处理对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的NQO1表达的影响的实验结果显示：将对照组即单纯人牙周膜细胞表达的NQO1量设置为1,则牙龈卟啉单胞菌脂多糖组表达的NQO1含量为1.71±0.11,250μg/mL桂花乙醇提取液组表达的NQO1含量为4.17±0.24,250μg/mL桂花乙醇提取液预处理2h再与牙龈卟啉单胞菌脂多糖、人牙周膜细胞共培养,NQO1的含量为5.06±0.38。由此可见,与单纯细胞培养组相比,脂多糖、提取液单独与人牙周膜细胞共培养都能增加细胞保护性酶NQO1的表达(P<0.05),且脂多糖组与提取液组相比,提取液能诱导人牙周膜细胞产生更多的细胞保护性酶NQO1(P<0.05)。提取液预处理使得脂多糖诱导的NQO1合成量表达更高,说明提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞抵抗脂多糖带来的毒性损伤。桂花乙醇提取液预处理对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的Nrf2表达的影响的实验结果显示：将对照组即单纯人牙周膜细胞表达的Nrf2量设置为1,则牙龈卟啉单胞菌脂多糖组表达的Nrf2含量为2.29±0.13,250μg/mL桂花乙醇提取液组表达的Nrf2含量为3.14±0.18,250μg/mL桂花乙醇提取液预处理2h再与牙龈卟啉单胞菌脂多糖、人牙周膜细胞共培养,Nrf2的含量为5.71±0.27。由此可见,与单纯细胞培养组相比,脂多糖、提取液单独与人牙周膜细胞共培养都能增加细胞保护性酶Nrf2的表达(P<0.05),且脂多糖组与提取液组相比,提取液能诱导人牙周膜细胞产生更多的细胞保护性酶Nrf2(P<0.05)。提取液预处理使得脂多糖诱导的Nrf2合成量表达更高,说明提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞抵抗脂多糖带来的毒性损伤。实验结果如下：● 牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使细胞内HO-1的含量从1增加至1.33±0.07。250μg/mL提取液预处理后HO-1的含量跃升至3.14±0.20,显著增加了人牙周膜细胞的抗氧化作用,提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞合成更多的HO-1抵抗脂多糖带来的毒性损伤。● 牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使细胞内NQO1的含量从1增加至1.71±0.11。250μg/mL提取液预处理后NQO1的含量跃升至5.06±0.38,显著增加了人牙周膜细胞的抗氧化作用,提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞合成更多的NQO1抵抗脂多糖带来的毒性损伤。●牙龈卟啉单胞菌脂多糖与人牙周膜细胞共培养,能使细胞核内Nrf2的含量从1增加至2.29±0.13。250μg/mL提取液预处理后Nrf2的含量跃升至5.71±0.27,显著增加了人牙周膜细胞的抗氧化作用,提取液与脂多糖具有协同作用,能够协助细胞合成更多的Nrf2抵抗脂多糖带来的毒性损伤。