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背景和目的食管癌是一种常见的恶性肿瘤,对人们的健康和生命构成了极大的威胁,其发病率较高,并且预后不良。食管癌有食管鳞癌和食管腺癌两种病理类型,我国较常见的发病类型为食管鳞癌。食管癌早期的症状和体征常不明显,大多数发现时已是中晚期。目前食管癌的临床治疗方法主要是手术结合放化疗,虽然化疗取得了一定的治疗效果,但仍有很多患者对化疗药物产生耐药性,所以食管癌的治疗方法有待于改善。随着分子生物学的发展,肿瘤的分子靶向治疗受到越来越多的关注。然而,食管癌目前缺乏有效的分子靶向治疗方法,并且针对食管癌的各种肿瘤标志物也很少,实现早期诊断和治疗比较困难。因此,筛选对食管癌有高亲和力和高特异性的识别分子,对食管癌的临床诊断和治疗有很重要的意义。核酸适配体(Aptamer)是一段能够和靶标高亲和力高特异性结合的寡核苷酸序列,Aptamer由指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机寡核苷酸文库中筛选获得。作为一种新型的靶向识别分子,Aptamer相对于传统靶向识别分子具有众多的优势,如易合成、易修饰、低成本、设计灵活性高、组织渗透性好、生物相容性好等优点。以活细胞为靶标的Aptamer筛选称为Cell-SELEX,经Cell-SELEX筛选获得的Aptamer可特异性靶向肿瘤细胞,在肿瘤的诊断、靶向治疗以及肿瘤标志物发现等方面具有重要的应用意义。本课题基于Cell-SELEX筛选技术,以紫杉醇耐药食管鳞癌细胞KYSE450/PTX、KYSE410/PTX为靶细胞,以食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE410为对照细胞,进行了两组Aptamer的筛选。对筛选得到的Aptamer结合性能进行考察发现,获得的Aptamer具备结合食管鳞癌细胞的能力。然而,本课题通过筛选没有得到与耐药食管鳞癌细胞特异性结合的Aptamer,分析原因可能是因为肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药的机制复杂,本课题针对细胞膜表面差异分子进行Aptamer筛选,如果耐药相关分子在靶细胞与对照细胞膜表面表达差异不明显,则可能难以筛选得到针对耐药食管鳞癌细胞的Aptamer。但是,通过两组Cell-SELEX筛选过程,我们得到了一条与食管鳞癌细胞结合亲和力较高的SYL-6 Aptamer,激光共聚焦成像实验显示SYL-6具备识别病人肿瘤组织的能力。Pull-down实验、Western blot实验和分子对接计算表明SYL-6结合的靶点可能为抗增殖蛋白2(PHB2)。此外,SYL-6能够携带化疗药物阿霉素靶向肿瘤细胞,具备一定的肿瘤靶向治疗应用潜能。方法1.Aptamer的筛选:通过CCK-8实验验证紫杉醇耐药食管鳞癌细胞KYSE450/PTX、KYSE410/PTX的耐药性。利用Cell-SELEX技术进行Aptamer的筛选,流式细胞仪分析筛选过程中文库的富集情况。2.Aptamer的性能表征:PCR实验用于扩增与靶细胞结合洗脱下来的ss DNA文库。流式细胞仪测定Aptamer与靶细胞和对照细胞结合的Kd值,检测Aptamer与靶细胞的结合温度,检测蛋白酶K和胰蛋白酶处理细胞以后Aptamer与靶细胞结合的情况。激光共聚焦成像实验检测Aptamer与靶细胞和对照细胞的结合情况,Aptamer识别病人肿瘤组织的情况。3.鉴定Aptamer结合的靶点:通过Pull-down实验及质谱分析找出与Aptamer结合的潜在靶点,Western blot实验、分子对接计算验证与Aptamer结合的潜在靶点。4.Aptamer的靶向治疗应用:通过荧光光谱仪检测Aptamer装载药物阿霉素的情况,CCK-8检测Aptamer载药复合物对肿瘤细胞的毒性作用,Calcein AM/PI试剂盒检测Aptamer载药复合物对细胞活性的影响。结果1.通过Cell-SELEX筛选得到三条Aptamer序列,分别为SYL-1/Y-4、SYL-6、Y-5。实验结果显示,这三条Aptamer的结合亲和力均在纳摩尔级,且能够在生理温度下高亲和结合靶细胞,其结合的靶标类型为蛋白质。2.流式分析结果显示三条Aptamer中,SYL-6能够结合多种肿瘤细胞,且结合的信号强度最高。此外,共聚焦成像实验表明SYL-6能够与结肠腺癌、食管鳞状细胞癌、乳腺浸润性导管癌、肝癌、胰腺癌,肾透明细胞癌等多种肿瘤组织结合。3.Pull-down实验、Western blot和分子对接计算结果表明SYL-6结合的靶点可能是PHB2。4.SYL-6可以作为药物载体装载阿霉素形成SYL-6-Dox复合物,对目标肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。结论1.通过Cell-SELEX筛选得到了一条Aptamer SYL-6,其结合亲和力高,不仅能够识别食管鳞癌等多种肿瘤组织,还可以作为药物载体装载阿霉素选择性杀伤食管鳞癌细胞。2.SYL-6结合的靶标可能是PHB2,具备作为肿瘤靶向治疗靶点的潜力。