气孔是由一对特化的表皮细胞—保卫细胞围成的孔状结构。钾离子流入或排出保卫细胞会改变其细胞膨压进而主导气孔开放与关闭过程的动态变化。保卫细胞中的电压门控K+吸收通道(Guard Cell K+Inward-rectifier，GCKin)的运作是控制气孔开放的关键机制。植物中已报道的这类通道在结构和作用特征等方面与拟南芥的KAT1高度相似，因此又称为KAT类钾通道。　　迄今已在多种植物中报道了KAT类钾通道，绝大多数该类钾通道的功能均受细胞外酸化过程的促进，从而有助于气孔的高效开放。而前期的研究发现，重要作物玉米中的同源通道ZmK2.1却缺失这一酸促进的气孔开放调控机制，其原因尚不明确。由于气孔是植物进行水分蒸腾和气体交换的主要门户，高效开放的气孔可通过持续蒸腾拉力的驱动促进植物根系吸收的养分向地上部分的传输，同时可保持光合CO2获取门户的畅通而促进光合碳同化过程，因此气孔的高效开放对提高作物的养分利用效率和产量的形成具有重要意义。水稻作为另一重要粮食作物和分子生物学研究的模式植物之一，对其气孔开、关的分子机制的探讨却并未引起足够的重视，也没有形成清晰、系统的理论认识。因此本论文通过非洲爪蟾蛙卵双电极电压钳电生理和定点突变技术重点研究了玉米ZmK2.1的独特质子调控机制，系统阐述了主导水稻气孔开放的OsKAT3通道的功能及调控特征;在此基础上利用水稻过表达和RNAi材料研究了这两个通道的生理作用。　　论文所获得的主要研究结果如下:　　1)因为ZmK2.1和受质子促进调控的拟南芥KAT1在氨基酸序列上具有高度相似性，所以首先对暴露在细胞膜外有可能接受外部质子调控且在二者之间氨基酸差异最大的S1-S2linker进行了置换和电生理测定。结果表明，质子对Kin钾通道(voltage-gated inward-rectifiers)K+吸收活性的促进作用是通过改变通道的半激活膜电位(V1/2)来实现的—低pH下通道的V1/2向膜电位的去极化方向平移，因而使得通道更易发挥活性，或在给定膜电位下通道开放的几率增加。S1-S2linker的置换使ZmK2.1和KAT1之间的质子调控特征发生了逆转:ZmK2.1获得了质子促进特征，而KAT1受质子调控的特性明显降低。因此，S1-S2linker是区别ZmK2.1和KAT1不同质子调控特征的关键。进一步以KAT1的S1-S2linker的氨基酸序列为参照，对ZmK2.1中的13个相应位点逐一进行单点突变和多点联合突变验证，发现单一氨基酸突变并不能改变其质子敏感性，而该S1-S2linker中的前8个电荷差异最大的氨基酸和后5个没有电荷差异的氨基酸分别对其质子敏感性起50％的控制作用，表明质子的调控是由S1-S2linker中的氨基酸所提供的整体作用结果。同时，linker后5个氨基酸中带负电的第92位D/E氨基酸和前8个差异最大的氨基酸同时置换可重现该linker整体置换所导致的质子敏感性逆转的现象。由此，揭示了S1-S2linker是KAT类钾通道质子调控网络中的一个尚未报道的新的组份。最后，拓扑结构模型预测发现包括ZmK2.1在内的已知KAT类钾通道S5跨膜区上的半胱氨酸(cysteine)可能作为一个潜在的酸滴定位点（质子结合位点），并在KAT类钾通道的质子调控网络中起核心作用。对ZmK2.1的这一位点(C208)进行突变则造成通道功能失活或S1-S2linker置换后不再继承KAT1的质子促进特征，验证了该位点在接受质子调控中的决定作用。S1-S2linker上的关键氨基酸与该位点（在ZmK2.1中为C208）的相互作用决定KAT类通道是否具有质子促进调控的特征:拟南芥KAT1的S1-S2linker中的K85位点可与C208形成稳定的氢键作用力（键长约3.0埃），因而表现为受细胞外质子的调控;而ZmK2.1中对应位点P85则远离C208，无法形成稳定作用力，所以表现为不受细胞外质子的调控。由于C208所在的位点在已报道的KAT类钾通道中高度保守，推测本文所揭示的质子调控作用机理模型可能在不同物种来源的气孔开放的质子调控机制中具有普遍意义。　　2)通过数据库检索，发现水稻基因组中共有3个钾通道被命名为OsKAT:其中OsKAT1主要在根中表达，因此其运作可能与气孔控制无关;在叶片保卫细胞中表达的OsKAT2和OsKAT3中，OsKAT2因其在N段天然缺失一段氨基酸序列，且在蛙卵细胞中不能介导K+电流，表明OsKAT2可能不具备完整的钾通道活性。因此，OsKAT3可能是水稻保卫细胞中起主导作用的Km通道。电生理研究结果证实了OsKAT3是一个典型低亲和力的钾离子吸收通道，Km值为63mM:对钾离子具有高度的选择性，受钾通道抑制剂Ba2+、Cs+和TEA的抑制及细胞内磷酸化过程的调控;意外的是，OsKAT3与ZmK2.1一样，其转运活性须在细胞外积累较高浓度的K+时才能激活，且该通道也同样缺失细胞外酸化过程对其转运活性的促进作用。因此，水稻中的气孔开放通道OsKAT3在同源性方面属于典型的KAT类通道，而在功能和调控机制上则类似于玉米中的ZmK2.1。因这两个通道的功能在一定程度上都受到外部K+浓度的制约并不能够被低pH促进，由此推断它们所主导的气孔开放过程可能是相对低效的。　　3)此外，包括玉米ZmK2.1在内的已报道的Shaker类（voltage-gated inward or outward rectifiers）植物钾通道的转运活性均受到细胞外Ca2+的抑制，但水稻中的OsKAT3却反常地表现为受细胞外Ca2+的促进，这一调控特征在已报道的植物钾通道中是独特的。为进一步揭示OsKAT3独特的Ca2+调控特性的结构基础，对OsKAT3和ZmK2.1的氨基酸序列进行了比对，在此基础上构建了一系列片段置换和单点突变的嵌合型通道，结果显示OsKAT3的第92位(92E)和第96位(96D)带负电荷的氨基酸决定了OsKAT3独特的钙调控特性，这2个位点可能为细胞外Ca2+结合位点。其中不同物种来源的KAT类钾通道在第92位相对应的位点均为带负电荷的氨基酸（E或D），而OsKAT3第96位负电荷氨基酸D则与大多数已知KAT类钾通道不同。水稻气孔开放控制通道采用这种独特的钙调控机制的生理意义以及由92E和96D共同决定的钙调控机制在不同物种来源的KAT类通道中是否具有普遍性，还有待将来进一步的解析和验证。　　4)为理解OsKAT3基因的生理功能，构建了该基因的RNAi沉默水稻，2个株系中OsKAT3转录丰度分别降低了94％和90％;同时为初步验证并克服水稻中可能存在的“气孔低效”的开放机制，分别创制了过表达玉米ZmK2.1和水稻OsKAT3的转基因水稻材料。田间试验和水培试验初步结果表明，在不施钾肥的条件下，RNAi沉默水稻2个株系的气孔开度分别降低了32％和35％，净光合速率分别降低34％和36％，蒸腾速率分别降低23％和29％，表明OsKAT3对水稻气孔的开放起着关键作用。在不施钾与正常施钾条件下，RNAi水稻2个株系的穗粒数和每穗饱满粒数均出现了显著降低，不施钾条件下籽粒产量减少了29％和19％，在正常施钾条件下籽粒产量减少了28％和24％。在低钾条件下，过表达ZmK2.1和OsKA T3则显著提高了分蘖数和千粒重，水稻籽粒产量分别增加了9％和20％。因此，高效的气孔开放对维持水稻籽粒的产量具有重要意义。　　综上所述，本研究发现了S1-S2linker是控制包括ZmK2.1和KAT1在内的KAT类气孔开放通道质子调控特征的新的结构基础，该linker与高度保守的质子结合位点C208（或等同对应位点）之间能否形成稳定氢键作用力是决定通道质子调控特征的分子机制。较系统地研究了水稻气孔开放控制通道OsKAT3的功能与调控特征，发现该通道的运作与玉米ZmK2.1类似，都需要细胞外部K+的积累以激活，且其转运活性均缺失胞外质子（低pH）促进的调控机制;此外，明确了OsKAT3具有与已知KAT类通道相反的Ca2+促进机制，该特性由通道的第92位(E92)和96位(D96)带负电荷的氨基酸决定。通过RNAi突变体水稻材料，证明了OsKAT3基因对水稻气孔开放过程的关键控制作用;超表达该基因或外源KAT类通道基因可以有效克服水稻气孔相对低效开放的缺陷，进而提高水稻的产量。