碳量子点基纳米探针的构建及其在活性氧靶向检测和清除方面的应用研究

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活性氧(ROS)是需氧型生物在新陈代谢过程中不可避免的一种代谢产物。在正常生理条件下,细胞内ROS的浓度稳定,其产生及清除处在动态平衡的状态。适度生成的ROS对机体免疫、信号传导等许多生理活动具有重要的意义。然而,在一些外源性和/或内源性刺激作用下,细胞内会产生并积累过量ROS,导致氧化应激的产生,造成蛋白质、DNA及RNA等生物大分子不可逆转的损伤,并进一步致使器官受损及引发中风、糖尿病、神经性疾病和癌症等严重疾病。因此,开发灵敏度高、选择性好以及响应速度快的检测手段来监测细胞内ROS的产生及浓度变化,以及原位、及时和高效地清除细胞内过量产生的ROS对维持正常细胞生理环境,预防及治疗ROS引起的相关疾病具有十分重要的意义。另一方面,碳量子点(CDs)是一类新型的荧光纳米材料,具有合成简便、光学性能稳定、表面性质丰富、细胞毒性低及生物相容性好等优点,已被广泛应用于生物及医学领域。利用杂元素掺杂以及表面改性等手段,有望构建一类对ROS具有良好的检测及清除性能的新型纳米探针,并进一步实现对特定细胞器内ROS的靶向检测及清除。本学位论文围绕以上内容,采用表面改性及硒(Se)和碲(Te)元素掺杂等方法,构建了多种对线粒体、溶酶体及内质网等细胞器中ROS具有靶向检测及清除性能的CDs基纳米探针。这些纳米探针在生物及医学领域具有潜在的应用价值。具体研究内容及结果如下:(1)以1,2,4-三氨基苯二盐酸盐为原料,通过微波法合成了表面含氨基的CDs,并通过酰胺化反应将香豆素-3-羧酸(CCA)以及(4-羧丁基)-三苯基溴化磷(TPP)基团共价修饰于CDs,构建了一种对羟基自由基(·OH)具有特异性检测以及具有线粒体靶向功能的比率型荧光探针CCA-TPP@CDs。形貌及化学组分分析证明了CCA-TPP@CDs良好的分散性、均一的尺寸分布,及功能基团的成功接枝。体外实验证明了CCA-TPP@CDs能选择性检测·OH,并具有宽的线性检测范围(0.1-160μM)及低的检出限(70 n M)。细胞内测试显示了CCA-TPP@CDs低的细胞毒性、良好的生物相容性以及线粒体靶向能力。基于这些优良性能,CCA-TPP@CDs被成功应用于线粒体中外源性或内源性·OH的检测。(2)以硒代胱氨酸为原料,通过水热法合成了Se掺杂的CDs(Se-CDs),并利用CDs的表面氨基通过酰胺化反应将吗啉基团共价修饰于CDs,构建了具有溶酶体靶向功能的抗氧化剂Lyso-Se-CDs用于溶酶体中·OH的清除。制备的Lyso-Se-CDs尺寸均一,具有良好的分散性及胶体稳定性。体外实验结果表明,由于Lyso-Se-CDs的氧化还原性,其对·OH具有很好的清除能力。细胞内测试显示了Lyso-Se-CDs低的生物毒性、良好的生物相容性、溶酶体靶向能力,以及对溶酶体中过量·OH的清除能力。随后建立小鼠耳朵炎症模型,通过荧光成像以及组织切片染色的方法,证明了Lyso-Se-CDs可有效地缓解小鼠耳朵炎症。(3)设计并合成了具有内质网靶向功能的3-(N-对磺苯甲酰胺)-乙基氨基-3-氧代丙酸乙酯(MOA)分子,并将其共价修饰于以硒代胱胺为原料通过水热法合成的Se-CDs表面,得到具有内质网靶向功能的抗氧化剂ER-Se-CDs。通过多种测试手段对MOA分子的结构,以及ER-Se-CDs的形貌和化学组分进行了表征,证明了MOA分子以及ER-Se-CDs的成功合成。体外实验及细胞内测试证明了ER-Se-CDs对·OH的清除能力,良好的生物相容性,以及内质网靶向功能,因此可保护细胞免受内质网中高ROS浓度带来的氧化应激伤害。小鼠耳朵炎症模型测试结果表明,ER-Se-CDs同样对由ROS诱发的炎症具有消炎作用。(4)以2,2’-二氨基二苯基二碲化物为原料通过水热法合成了Te掺杂的CDs(Te-CDs)。实验结果表明,Te-CDs尺寸较小且均一,具有很好的分散性及胶体稳定性。Te-CDs优良的氧化还原响应性使其能快速(~40 s)且选择性检测超氧阴离子(O2·-),并显示出较宽的线性检测范围(0.5-16μM)和低的检出限(80 n M)。O2·-清除实验则证明了Te-CDs对O2·-同样具有很好的清除能力。随后通过酰胺化反应将TPP修饰到Te-CDs表面,得到集O2·-检测、清除及线粒体靶向功能于一体的TPP-Te-CDs。体外测试表明TPP的修饰不会影响Te-CDs对O2·-的检测及清除能力。细胞内测试显示了TPP-Te-CDs的低生物毒性、良好的生物相容性以及线粒体靶向功能。该纳米探针被成功应用于线粒体中O2·-的检测及清除,证明了其保护细胞减少氧化应激伤害的能力。
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