目的 构建压电免疫微阵列传感器检测系统，并对抗体包被和晶片再生等条件进行优化，在此基础上对绿脓杆菌进行检测和分型，以探索临床应用的可行性。 方法 1．首先利用精细微加工法制作单个石英谐振式传感器，并在其两面光刻出金膜电极，在此基础上先后构建了夹具式2×5型传感器阵列以及拔插式2×5型传感器阵列，并自行开发研制自激式振荡电路、PESA V2.0版频率记录分析软件，与计算机联用构建石英免疫传感器微阵列检测系统。 2．分别用SPA法及生物素-亲和素固定法固定绿脓杆菌单克隆抗体，从抗体固定量、频率响应特性以及非特异性反应等方面比较了两种方法的优劣。 3．比较甘氨酸-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、piranha液以及强碱和强酸四种洗脱液对晶片再生的作用。 4．探讨温度对抗体固定量、频率响应特性及芯片保存时间的影响。 5．在免疫传感器微阵列表面固定绿脓杆菌单克隆抗体，对绿脓杆菌菌液进行检测，频率下降值与吖啶橙荧光显微镜直接计数法结果对应进行定量研究，绘制用于检测的标准曲线并进行曲线拟合。 6．在免疫传感器微阵列表面固定绿脓杆菌分型血清，对绿脓杆菌进行分型，与玻片凝集法分型结果进行对比。 7．对50例临床标本进行的检测与分型，并与传统分析方法对比，探讨检测临床标本的可行性。 结果 1．构建的石英免疫传感器微阵列检测系统完全满足实验要求。 1．1 AT切型石英晶体更有利于传感器在液相中的稳定，金膜电极厚度在100nm-150nm的范围内最适合于用作免疫反应的检测，电极直径4.0mm时插损较小、对质量负载承受能力强。 1．2 夹具式传感器微阵列和拔插式传感器微阵列均成功实现了传感器在气、液相中的稳定振荡(气相频率±1Hz、液相频率±2HZ)。第三军医大学硕士学位论文 1.3自行开发的PESA V2.0版频率记录分析软件具有自行设置各初始参数、实时记录频率变化、自动绘制频率变化趋势图及分析结果等多项功能，采集、分析后的数据自动输入到计算机。 2.两种抗体固定方法检测细菌的灵敏度相当。但SPA法操作较为简单，固定抗体的量、反应频率响应值均大一些，且反应时间较短，非特异性响应低。 3.Pirar山a液具有较好的清洗效果而且重现性也较好，在重复使用30次后，信号响应值仅下降5%左右，是一种较为理想的晶片再生剂。 4.温度对抗体固定量、频率响应特性及芯片保存时间均有较大的影响。 4.1温度在4℃时抗体固定量最大，以后随温度增加而降低。 4.2温度在35℃一37℃频率响应最大，达到反应平衡的时间最短。 4.3在4℃保存芯片较好，60天抗体活性降低到原有活性的70%左右。 5.绿脓杆菌菌液的浓度在1护一1护cells/nil范围内，绿脓杆菌菌液的浓度与传感器频率的变化之间呈良好的指数线性关系，指数式回归方程为△F=12.6625 xCO·’757，厂0.9949。通过对未知浓度的绿脓杆菌菌液进行检测，定量结果与叮睫橙荧光显微镜直接计数法的相关系数r为0.973。 6.用压电免疫传感器对6株绿脓杆菌标准菌株进行分型，结果与玻片凝集法分型结果完全一致。 7.在对50例临床标本检测过程中，34例标本检测结果为阳性，在阳性标本中共获得分型31例。 7.1 34例阳性结果标本经培养全为阳性，但传感器确定的16例阴性标本经培养有3例培养结果为阳性。两种方法经xZ检验，p值大于0.05。 7.231例分型与玻片凝集实验结果完全一致。 结论 1.新型石英谐振免疫传感器检测仪具有稳定、实用的优点，可用于多种免疫反应的检测。 1 .1通过优化选择，压电石英晶片的敏感性和响应特性都得到极大的提高。 1 .2新型夹具式及拔插式传感器微阵列可有效解决传感器在液相中频率稳定的难题。 1.3“PESAvZ.o”应用软件是一种可实时记录与分析石英晶体谐振频率变化的新型实用性软件。 2 .SPA法是免疫传感器抗体固定的理想方法。 3.PiraJ比a液是一种较为理想的晶片再生剂，但从成本方面来考虑，柠檬酸盐缓冲液也是一种经济合算的晶片再生剂。我们在实际应用中应根据具体实验的需要灵活地加以选择。第三军医大学硕士学位论文 4.温度对抗体固定量、频率响应特性及芯片保存时间均有较大的影响。 5.应用压电石英晶体绿脓杆菌微阵列免疫传感器能够对绿脓杆菌进行的定量分析和血清学分型，与标准的AODC法和玻片凝集法无明显差别。 6.通过对临床标本检测，我们认为压电免疫传感器微阵列检测绿脓杆菌时间短，结果准确，无需长时间培养，有较高的推广应用价值。