目的动脉粥样硬化是脂质代谢异常导致的动脉血管壁的慢性炎症性疾病,是心绞痛、急性心肌梗死或猝死等急性冠状动脉综合征的主要病理基础,已经成为严重影响我国中老年人健康的常见疾病,并有逐年递增趋势。关于动脉粥样硬化发病的确切机制尚不清楚。越来越多的证据显示CD4+T细胞介导的炎症在动脉粥样硬化的发生、发展中发挥重要作用。CD4+T细胞是一类异源性群体,主要包括Th1、Th2细胞、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)以及新近发现的Th17细胞。多数研究认为Thl细胞可以促进动脉粥样硬化的发生,Treg和Th2细胞主要是抑制作用。最近我们和其他学者在小鼠模型的研究显示Th17具有促进动脉粥样硬化形成的作用,然而,Th17与人动脉粥样硬化的关系及其作用机制尚不清楚。本研究首先分析1L-17/Th17在急性冠脉综合症(不稳定型心绞痛和心肌梗死)病人外周血的变化,发现病人外周血IL-17和Th17细胞均明显升高。因为IL-17是Th17细胞的主要效应分子,所以我们从动脉粥样硬化起始因素血管内皮细胞损伤和内皮细胞与单核细胞粘附入手,研究IL-17在动脉粥样硬化形成过程中的作用机制。主要包括一下三方面的内容：一、Th17与人动脉粥样硬化症的相关性研究；二、Th17主要效应分子IL-17对血管内皮细胞功能的影响及其机制研究；三、Th17主要效应分子IL17对内皮细胞与单核细胞黏附的影响及其机制研究方法一、Th17与人动脉粥样硬化症的相关性研究1.病人及正常对照：所有40名病人均源自齐鲁医院心内科和省立医院急诊科,其中急性冠脉综合症病人24人、稳定性心绞痛病人16人。健康人对照18人2.流式细胞术检测：应用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC)(注：同时收集血浆-80℃保存备用)。PMA刺激PBMC,胞内染色,流式细胞术检测CD4+IL-17+T细胞和CD4+IFN-g+T细胞及CD4+CD25highCD127low/-T (Treg)细胞,研究病人外周血Th17、Thl和Treg细胞的变化。3. ELISA检测：ELISA方法检测待检者血浆中IL-17、IFN-γ、TGF-β和IL-6水平,并同时收集病人外周血脂代谢相关数据。4.统计分析：分析Thl7及相关细胞变化及相关性,统计分析血浆IL-17、TGF-b和IL-6水平,分析IL-17与相关炎性因子的相关性。二、Th17主要效应分子IL-17对内皮细胞的损伤及其机制研究1.HUVEC细胞IL-17RA受体表达分析：RT-PCR和流式细胞术检测不同待检者来源的HUVEC细胞IL-17RA受体表达情况。2.IL-17对HUVEC细胞VWF表达的影响不同浓度IL-17刺激HUVEC细胞24小时,分别收取细胞和培养上清,分别用RT-PCR和ELISA方法研究IL-17能否促进VWF表达。3.IL-17对HUVEC细胞凋亡的影响IL-17刺激HUVEC 48小时,用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测IL-17对HUVEC凋亡的影响。4.IL-17促进HUVEC细胞凋亡的机制研究首先应用western blotting研究凋亡相关蛋白表达情况；其次流式细胞术检测细胞线粒体的完整性,研究IL-17是否可以通过线粒体途径诱导HUVECs凋亡。三、Th17主要效应分子IL-17对内皮细胞与单核细胞黏附的影响及其机制研究1.1L-17对血管内皮细胞与单核细胞黏附作用的影响我们首先运用活细胞工作站实时监测不同浓度的IL-17对血管内皮细胞(HUVEC)与人类单核细胞系THP-1黏附的影响,发现低浓度的IL-17(1ng/ml)即可迅速促进二者相互作用。然后应用试剂盒定量检测,先用不同浓度IL-17刺激HUVEC适当时间(0.5或3小时),再将二者共孵育0.5小时,多标记分析仪定量分析IL-17对内皮细胞(HUVEC)与单核细胞(THP-1)黏附的影响。2.适时定量PCR检测IL-17对黏附分子的表达的影响根据黏附实验选择适当浓度的IL-17(10ng/ml)刺激HUVEC细胞0.5、1和3小时,提取总RNA,实时定量PCR和流式细胞术检测HUVEC表达黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-选择素和P-选择素。3.钙离子对IL-17促黏附作用的影响我们用不同浓度钙离子螯合物先处理HUVEC细胞30分钟,再和IL-17(10ng/ml)共刺激HUVEC细胞30分钟或3小时,最后加入经calcein AM染色处理的单核细胞(THP-1),共孵育30分钟,多标记分析仪检测。4.IL-17可促进内皮细胞极化细胞极化是细胞粘附过程中的早期事件,是细胞相互间有效作用所必需的。IL-17是否可以促进内皮细胞极化,无文献报道。为此,我们用不同浓度的IL-17刺激HUVEC 30分钟,固定后并用荧光素标记的抗-ICAM-1和VCAM-1处理HUVEC,最后荧光显微镜观察细胞极化现象。5.IL-17A对HUVEC细胞钙离子内流的影响IL-17 (10ng/ml)刺激HUVEC细胞,刺激时间为5分钟、15分钟和30分钟,然后用fluo-3A标记HUVEC细胞内游离钙离子,最后流式细胞术检测。6.钙离子介导的细胞极化与IL-17的促黏附作用THP-1先用CFSE染色处理并正常培养24小时,IL-17刺激HUVEC30分钟,再与CFSE处理THP-1共孵育15和30分钟,最后用PE标记的抗人ICAM-1抗体(PE-anti human-ICAM-1 Ab)标记HUVEC细胞,荧光显微镜观察。结果一、Thl7与人动脉粥样硬化症的相关性研究1.人外周血Th17及Thl和Treg亚群在动脉粥样硬化症发展中的变化为了研究CD4+T细胞亚群在人动脉粥样发生发展中的作用,我们首先采用流式细胞术对病人和健康人外周血CD4+T细胞中Th17(CD4+IL-17+)、Th1 (CD4+IFN-γ+)和Treg(CD4+CD25highCD127-)等亚群进行了分析,结果发现Th17亚群和Thl亚群在急性冠脉综合症(ACS)病人外周血中明显高于稳定型心绞痛病人和正常人,Treg在急性冠脉综合症(ACS)病人外周血中的比例明显低于稳定型心绞痛病人和正常人,但在稳定型心绞痛(SA)病人与正常人间无明显差异。说明Thl7和Th1、Treg一样可能参与急性冠脉综合症的发生,而与稳定性心绞痛关系不明确2.Th17主要效应分子IL-17在动脉粥样硬化发展中的变化目前有关Thl和Treg在急性冠脉综合症的研究相对较多,由于Thl7发现较晚,故对其研究尚少。为了深入研究Th17在急性冠脉综合中的作用,我们采用ELISA法进一步分析了TH17的主要效应分子IL-17在病人和正常人血清的水平,结果发现与Th17的比例变化相似,急性冠脉综合症(ACS)病人外周血中的IL-17明显高于于稳定型心绞痛病人和正常人,但在稳定型心绞痛(SA)病人与正常人间无明显差异,进一步说明Th17主要与急性冠脉综合症的发生有关,与稳定型心绞痛关系不大。3.Th17分化相关细胞因子IL-6和TGF-bata在动脉粥样硬化发展中的改变及其与IL-17的相关关系已知CD4+T细胞的分化与环境中的细胞因子有直接关系,在TGF-β存在下,活化的CD4+T细胞优先向Treg分化,在TGF-β和IL-6共同存在下,活化的CD4+T细胞则向Th17分化,为了分析ACS病人外周血Th17升高的原因,我们检测了病人和正常人血清中IL-6和TGF-β的水平并对其与IL-17的相关性进行了分析,结果发现与健康人相比,ACS病人外周血IL-6明显升高、TGF-β显著降低,高浓度IL-6与TGF-β有利于Thl7分化。而稳定型心绞痛病人IL-6和TGF-β水平较正常人没有明显变化。相关性分析发现,ACS外周血IL-6与IL-17高度正相关。4.Th17效应分子IL-17与危险因素的关系已知脂质代谢和糖代谢异常是动脉粥样硬化的发生发展的危险因素,为了分析IL-17/Th17细胞是否可通过影响脂质代谢和糖代谢参入ACS的发生,我们进一步分析IL-17与总胆固醇(CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖(G1u)的关系,发现IL-17与上述四种危险因素均无相关性。这说明在ACS形成过程中,IL-17不通过干扰糖和脂类代谢影响ACS的发生二、Th17主要效应分子IL-17对内皮细胞的损伤及其机制研究1. HUVEC表达IL-17RA尽管AACS病人外周IL-17水平升高,但没有IL-17参与ACS形成的直接证据。内皮功能异常在动脉粥样硬化及其斑块形成中发挥重要作用,由此我们直接检测IL-17对血管内皮细胞的影响。我们首先应用RT-PCR和流式细胞术检测人气静脉内皮细胞(HUVEC)IL-17RA表达情况,发现HUVEC低水平表达II-17RA,即HUVEC是IL-17的靶细胞。2.IL-17可直接引起血管内皮细胞的损伤血管内皮细胞损伤和功能改变是动脉粥样硬化的起始因素。VWF因子血管内皮细胞产生的一种糖蛋白,内皮细胞损伤分泌量会上调,故外周血VWF因子水平被作为内皮细胞功能异常的标志分子。我们发现IL-17可明显上调HUVEC细胞VWF因子mRNA和蛋白的表达水平,并具有剂量依赖性,说明IL-17可导致内皮细胞功能异常和损伤。3.IL-17可促进内皮细胞(HUVEC)凋亡为了研究IL-17促进内皮细胞损伤的作用机制,我们进一步用流式细胞术(AnnexinV和PI标记)研究了IL-17对内皮细胞凋亡的影响,发现低浓度的IL-17对HUVEC凋亡影响不明显,高浓度时作用明显,并呈现剂量依赖的方式促进内皮细胞的早期凋亡,说明IL-17可能通过促进内皮细胞凋亡而介导内皮损伤的。4.IL-17可通过线粒体途径诱导内皮细胞凋亡为了研究IL-17促进内皮细胞凋亡的信号通路,我们采用western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性片段,结果显示,IL-17可明显上调Caspase3和caspase9,而对caspase8表达影响不明显,线粒体促凋亡蛋白Bax与凋亡抑制蛋白Bcl-2比值明显升高,提示IL-17主要是通过线粒体通路介导细胞凋亡。为了进一步证明我们的观点,我们应用MitoCaptureTM试剂盒检测线粒体完整性,证实IL-17可以促进HUVEC细胞线粒体膜损伤。由以上结果说明IL-17可通过线粒体途径诱导HUVEC细胞凋亡。三、Th17主要效应分子IL-17对内皮细胞与单核细胞黏附的影响及其机制研究1.IL-17促进内皮细胞与单核细胞黏附单核细胞与内皮细胞的粘附是动脉粥样硬化形成的重要事件,为了研究Thl7促进动脉粥样硬化形成的机制,我们运用活细胞照相技术发现即使低浓度的IL-17(1ng/ml)即可有效促进人单核细胞系THP-1和HUVEC相互粘附,且作用迅速,15分钟之内THP-1即有明显促进作用；定量粘附分析发现IL-17作用于HUVEC 30分钟和3小时均可有效促进其与单核细胞(THP-1)粘附,且具有剂量依赖性。说明IL-17具有促进单核细胞与内皮细胞的快速黏附的作用2.IL-17的快速促黏附作用不是通过上调黏附分子表达实现的已知黏附分子在细胞黏附过程中发挥关键作用,那么IL-17促黏附作用是否通过上调黏附分子实现?结果发现尽管IL-17作用30分钟即可促进单核细胞与血管内皮细胞的粘附,但是实时荧光定量PCR结果显示此时IL-17对HUVEC细胞E-选择素、P-选择素及ICAM-1和VCAM-1等黏附分子mRNA的表达没有影响,直到IL-17作用3小时后这些粘附分子mRNA的表达才上调,流式细胞术结果显示30分钟内黏附分子无上调,说明IL-17的快速促黏附作用不是通过上调黏附分子表达实现的。3.IL-17短时刺激可促进内皮细胞极化IL-17的快速促黏附作用不是通过上调黏附分子表达实现的,那么IL-17是否是通过影响细胞表面分子极化分布而促进其余单核细胞黏附的呢?我们用IL-17刺激HUVEC30分钟,通过免疫荧光染色显微镜观察发现IL-17促进HUVEC细胞ICAM-1和VCAM-1分子向与单核细胞接触的部位聚集,即粘附分子发生了极化分布,提示IL-17促粘附作用可能与内皮细胞极化有关。4.IL-17介导的粘附附分子极化可能与细胞内钙离子浓度瞬间变化有关已知钙离子可通过调节细胞骨架蛋白装配参与细胞极化过程。为了研究IL-17是否可通过改变细胞内钙离子浓度进而影响粘附分子的极化,我们用钙离子特异染色剂Fluo-3A处理IL-17刺激的HUVEC细胞,流式细胞术检测胞内荧光强度,分析了IL-17细胞内钙离子浓度的影响,发现IL-17作用5分钟即可使HUVEC细胞内钙离子浓度瞬间升高,15分钟时,细胞内钙离子浓度,即基本恢复之初始状态。提示IL-17可以通过促进钙离子内流促进单核细胞与内皮细胞的早期黏附作用。结论1.ACS病人外周血效应性Thl7和Th1细胞比例升高,调节Treg细胞水平降低,而稳定型心绞痛病人与正常人无明显区别。2.Thl7细胞主要效应分子IL-17和IL-6在急性冠脉综合症时明显升高而TGF-β明显降低,其中外周血IL-6与IL-17高度正相关,而TGF-β与IL-17呈负相关,而IL-17的水平与糖和脂质代谢异常无明显相关性,这说明在ACS形成过程中,IL-17不通过干扰糖和脂类代谢影响ACS的发生。3.我们发现IL-17可通过线粒体途径直接诱导内皮细胞凋亡促进内皮损伤,这可能是IL-17促进动脉粥样硬化发生发展的机制之一。4.IL-17可快速促进内皮细胞与单核细胞的早期黏附作用,且这种快速促黏附作用主要是通过内皮细胞的极化实现的,与调黏附分子的表达上调关系不大。5.IL-17介导的细胞外钙离子瞬间内流与IL17介导的粘附分子极化和促粘附作用有关,而IL-17通过活化PLC-γ1促进HUVEC胞内钙离子上调。总之,IL-17/Th17在ACS病人外周血均明显升高,Th17细胞的主要效应分子IL-17,可能通过诱导血管内皮细胞损伤和改变内皮细胞的粘附功能参与动脉粥样硬化及其斑块形成的。动脉粥样硬化是一种慢性自身免疫性疾病,T细胞参与动脉粥样硬化及其斑块的形成。CD28与B7分子结合产生协同刺激信号是T细胞活化最重要的协同刺激信号,阻断CD28的作用可有效抑制T细胞活化。以往常用的阻断分子包括CD28特异性阻断抗体和多肽,但是阻断性抗体是鼠源性的,因具有免疫性而影响治疗效果,多肽免疫原性弱,但是不稳定。类肽—是一种在甘氨酸分子基础上,将修饰侧链接到N原子上,得到的N—取代甘氨酸多聚体,分子量小,对蛋白酶稳定。根据CD28与B7分子的作用位点结构,我们从合成的19种类肽中,筛选出一种CD28高亲和力的类肽(N0.9),并作了初步研究。为了进一步研究此类肽的功能,我们分别在体外和体内验证其功能。方法1.T淋巴细胞增殖抑制实验常规方法分离人外周血单个核细胞(PBMC),设PHA组、PHA+anti-hCD28-Ab和PHA+anti-hCD28-Ab+peptoide组,先培养56小时,再添加3H-TdR继续培养72小时,收集细胞进行放射性检测。2.小鼠脾脏T淋巴细胞增殖抑制实验因为人和小鼠CD28高度同源,所以我们用小鼠脾脏T细胞,与方法一相同分组,验证合成类肽对小鼠T细胞的增殖抑制作用。另外,我们选用小鼠脾脏细胞做为混合淋巴细胞培养实验材料,验证NO.9类肽的抑制效应。分别获取C57BL/6和BALB/c小鼠脾脏细胞并破红细胞。BALB/c小鼠脾脏细胞做为刺激细胞,用丝裂霉素处理,设不同浓度类肽NO.9抑制组。C57BL/6和丝裂霉素处理的BALB/c脾细胞共培养56小时,再添加3H-TdR继续培养72小时,收集细胞进行放射性检测。3.移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠模型的建立和干预方法BALB/c受体鼠(SPF级)于移植前4-6小时接受X-射线照射,总剂量为6.5cGy。获取C57BL/6小鼠骨髓细胞与脾细胞等量混匀,尾静脉输入X-射线处理的BALB/c受体鼠。类肽药物治疗组小鼠每天给予腹腔药物注射。GVHD对照组小鼠注射PBS溶液。无菌鼠笼内喂养。每天观察对小鼠的临床症状进行积分分析；每周三次记录小鼠的生存率；取小鼠的肝、肠组织做病理切片,HE染色评估组织病理变化。二、结果：1.CD28拮抗类肽对人T淋巴细胞体外增殖的抑制效应为了研究CD28拮抗类肽体外是否可抑制T淋巴细胞增殖。我们用PHA或anti-CD3和anti-hCD28-Ab刺激人外周血单个核细胞(PBMC)增殖并加入CD28拮抗性类肽进行干预。3H-TdR掺入法检测增殖效应,发现CD28拮抗类肽可明显抑制anti-CD3和anti-hCD28-Ab或PHA刺激的人PBMC增殖。2.CD28拮抗类肽小鼠T淋巴细胞体外增殖的抑制效应由于人和小鼠CD28与B7分子结合位点序列相同,No.9类肽也可以抑制由抗小鼠CD3和CD28单抗刺激的小鼠淋巴细胞增殖效应。在小鼠混合淋巴细胞培养实验中,做为APC细胞的BALB/c脾细胞可明显刺激效应细胞—C57BL/6脾细胞的增殖,No.9类肽则可抑制BALB/c脾细胞这一功能。所以,No.9类肽可抑制同种异型抗原刺激的淋巴细胞增殖。3.CD28拮抗类肽对小鼠骨髓移植后移植物抗宿主疾病的抑制效应为了验证CD28结合性类肽在体内能否抑制由同种异型抗原诱生的免疫炎症,我们以C57BL/6小鼠作为供体,BALB/c小鼠作为受体,诱导发生GVHD。移植后1-8天,我们观察腹泻、体重下降、活力下降和弓背等临床症状,没有应用类肽治疗的移植小鼠GVHD的临床积分会迅速升高,第5天时达到最高值,并且可以维持4周。治疗组小鼠每天腹腔注射10μg/只No.9类肽,其临床积分在5-18天比无治疗组约低2分。生存率观察显示对照组(无治疗组)第三天开始有死亡,14天时有70%死亡,28天死亡为100%。而治疗组第7天才开始死亡,14天死亡率仅为25%,但是28天时也全部死亡。19天时,肝脏和结肠组织病理变化非常明显,组织化学法观察组织出血、坏死和充血情况。HE染色结果显示,对照组肝脏和结肠组织有大量淋巴细胞浸润,而治疗组组织炎症明显受抑制,由此推测No.9类肽通过抑制同种异性抗原诱导的炎症而减轻GVHD疾病的。三、结论：我们合成并筛选出的人CD28高亲和力类肽,能抑制T细胞活化,对T细胞介导同种异型抗原诱导的GVHD也具有治疗作用。也即我们合成了一种能抑制CD28功能从而抑制T细胞活化的类肽分子。