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辣椒疫病是一种世界性土传病害,严重影响我国及世界各国的农业生产,造成巨大的经济损失。该病由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)所引起。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎;寄主范围广,可以侵染辣椒、西葫芦、黄瓜、番茄等9科20多种作物。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,寻找探索辣椒疫霉菌重要的致病因素成为科学家研究的对象。其中,多聚半乳糖醛酸酶(PG)是许多植物病原菌的致病因子,在植物发病过程中起重要作用。本研究以辣椒疫霉为研究对象,对来自我国不同地区的辣椒疫霉进行了群体遗传学研究,并分析了其致病力与地理位置、菌株起源的关系。筛选多聚半乳糖醛酸酶活性最高的辣椒疫霉菌株,并构建了其基因组DNA文库,应用Pool PCR方法分离和克隆了7个pg基因。构建了pcpg2基因的真核和原核表达载体,通过诱导表达获得重组蛋白,并制备了特异性抗体;应用RT-PCR和Northern-Blotting方法分析了其在辣椒体内的表达情况;纯化真核表达蛋白接种辣椒叶片,观察其发病症状。主要研究内容如下:2004-2005年,从我国山东、陕西、湖北、浙江、广东、四川、云南等地采集辣椒疫病病株及病土分离鉴定辣椒疫霉菌株。通过利用12个随机引物对来自我国7个不同地理区域的56个辣椒疫霉菌株进行RAPD分析,探索了我国主要辣椒种植区间的辣椒疫霉菌的遗传分化关系。结果表明:我国主要辣椒种植区的辣椒疫霉菌具有较丰富的遗传多样性;并将供试56个菌株划分为8个基因型(I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII),结合我国不同地理区域辣椒疫病发病情况,提出我国辣椒疫霉菌基因型的划分除少数与地理区域有关外,其它绝大多数地区的辣椒疫霉菌基因型的划分与地理来源无直接的相关性。利用游动孢子悬浮液浸根法测定辣椒疫霉菌株致病性,发现受试31菌株被划分为非致病型、弱致病型和强致病型的三种致病型。对其进行RAPD分析发现,不同致病型的辣椒疫霉具有丰富的遗传多样性,并划分为两个大的基因型,但与菌株的致病型没有显著的关系。上述试验结果说明,来自不同地区的辣椒疫霉菌存在明显的致病型分化,并有丰富的基因型,但两者之间无明显的对应关系。利用RAPD技术对来自我国地区的致病性和非致病性辣椒疫霉菌株进行群体遗传多样性分析,受试致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分别聚为一组,但其中两个非致病性菌株与致病性菌株聚为一组。ITS(ITS1-5.8SrDNA-ITS2)序列分析结果表明,受试致病性和非致病性辣椒疫霉菌株分别聚为一个组。但非致病性辣椒疫霉菌的群体遗传多样性比致病性的要高,这说明致病性菌株可能是单系群起源。此外,致病性和非致病性辣椒疫霉菌株遗传多样性与其致病性没有明显的相关性。上述研究表明,我国辣椒疫霉菌存在丰富的遗传多样性及明显的致病分化现象,但两者之间无直接的相关性。采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)分光光度法测定辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,并构建基因组文库。利用Pool PCR法分离克隆pg基因,对其结构特征进行分析。结果发现,辣椒疫霉菌复壮后PG活性高于复壮前,且致病性菌株的PG活性高于非致病性菌株,构建了PG活性最高最稳定的菌株的基因组DNA文库。从文库中共分离克隆了7个pg基因,其GenBank注册号分别是DQ365796、DQ415987、DQ415988、EF558848、EF558847、EF558846及EF558845。对其序列和蛋白结构进行分析发现, 7个pg基因具有很高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点。所编码的蛋白具多聚半乳糖醛酸酶的保守序列和蛋白活性位点(NNYCSGGHGISIGS),其蛋白结构也具明显的相似性。本研究发现,辣椒疫霉的pg基因与卵菌的pg基因聚在一起,亲缘关系最近,进一步证明了卵菌在自然界中的分类地位。根据已经克隆的pcpg2基因的序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建成重组表达载体pPIC9K-pcpg2,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经过G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合。通过将酵母分泌的PG蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western- blotting分析结果表明,表达的目的蛋白与制备的抗体在37KDa处特异性地结合。总之,pcpg2基因在酵母中得到了表达,并制备了特异性抗体。根据pcpg2已知序列设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽序列。重组至原核表达载体pET-22b(+),构建成重组表达载体pET/pcpg2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳显示在37KDa处有一特异性蛋白带出现,Western-blotting检测表明已经成功表达了融合蛋白,更验证了已制备的抗体的特异性。培养辣椒疫霉菌,接种4-6叶期辣椒叶片。根据pcpg2的序列设计特异性引物,RT-PCR检测接种叶片内pcpg2的表达情况。结果发现,接种后pcpg2表达量随着时间延长而加强,第7天pcpg2表达量最高。设计引物,PCR扩增片断以制备探针,Northern -blotting结果表明,pcpg2基因在接种辣椒叶片内得到表达,而未接种叶片则没有表达。纯化真核表达蛋白PG2,提取辣椒叶片细胞壁,DNS法测定活性结果表明,纯化的PG2对辣椒叶片细胞壁具有一定的活性。利用针刺法将纯化的PG2接种4-6叶期辣椒叶片,发现接种PG2的叶片出现病斑,表现出发病症状,而接种无菌水的叶片则没有表现症状。这表明pcpg2可能是编码辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因家族中的致病基因之一。