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该研究为研制新型表达HIV-1多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性、增强表达HIV-1多价抗原重组痘苗病毒疫苗的免疫原性进行探索.B8R基因广泛存在痘苗病毒中,编码可溶性IFN-γ受体的同源蛋白,可竞争结合IFN-γ,中和IFN-γ在抗病毒及免疫调节生物学活性.为此本研究构建缺失IFN-γ受体基因(B8R基因)的天坛株重组痘苗病毒载体,初步研究其毒力改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性.采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7.5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RlacZ,构建在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段外侧插入痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列转移质粒pSKB8RNeo.将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTT△B8RlacZ.经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确,核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VTT△B8RlacZ在CEF细胞连续培养传代B8R基因缺失稳定,插入外源基因lacZ稳定表达.VTT△B8RlacZ在细胞中的繁殖复制水平与天坛株痘苗病毒相当.兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力.研究表明B8R基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株毒力,B8R基因缺失区可能作为外源基因插入稳定表达区.为提高表达HIV多价抗原重组痘苗病毒安全性、免疫原性,本研究利用新的载体系统构建缺失IFN-γ受体基因(B8R基因)不带标记基因的TK区表达B/C型CN54株HIV-1外源多价抗原env、gagpol的重组痘苗病毒VTKfpe△B8R.将TK区表达HIV-1外源多价抗原env、gagpol的重组痘苗病毒VTKgpe与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpe△B8RlacZ.再以VTKgpe△B8RlacZ .将重组痘苗病毒VTKgpe△B8R、VTKgpe与DNA疫苗pcDNA-syngag,pcDNA-syngp120(分别含HIV-1 CN54毒株经密码子优化的合成基因syngag和syngp120)联合或重组痘苗病毒单独免疫BALB/c小鼠.ELISA检测免疫小鼠产生HIV-1特异性抗gag、gp120结合抗体没有显著差异.另外,利用该载体系统还构建表达SARS病毒多价抗原的重组痘苗病毒.通过重组PCR技术、多步克隆在转移质粒pSKB8R的痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段之间插入SARS病毒核衣壳N蛋白合成基因及其上游的痘苗病毒背向双启动子序列pE/L+p7.5,在痘苗病毒启动子序列pR/L下游插入SARS病毒spike蛋白S基因,在B8R右侧同源序列B8RR片段外侧插入痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列,构建转移质粒pB8RNPSNeo.