目的缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion Injury, IRI)是临床上一种常见的病理生理现象,肾脏作为高灌注器官,非常容易发生IRI,临床上因为IRI而导致的急性肾功能衰竭(Acute Renal Failure,ARF)的现象非常多见,其发病机制尚未完全清楚,且无很好的防治手段。肾缺血再灌注损伤时的病理生理变化一直是许多学者研究的重点。本研究通过制作大鼠肾缺血再灌注损伤模型,研究急性肾缺血后不同再灌注时间热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达规律及其对肾缺血再灌注损伤的保护作用,研究活血化瘀中药对大鼠肾缺血再灌注损伤时热休克蛋白70表达的影响,探索药物诱导机体产生热休克蛋白70的可行性。方法1、实验分组:普通级雌性SD大鼠108只,体重200±20g随机分为三组。A组(完全空白组):36只,按照再灌注0、6、12、24、36、48小时随机分6小组,每组6只,分离左右两侧肾蒂,但不阻断肾供血。B组(生理盐水组):36只,建立双侧肾蒂夹闭45分钟的大鼠缺血再灌注模型,按照再灌注0、6、12、24、36、48小时随机分6小组,每组6只。手术前5-10分钟从股静脉注射生理盐水0.5ml∕0.1kg。C组(活血化瘀中药组):36只,建立双侧肾蒂夹闭45分钟的大鼠缺血再灌注模型,按照再灌注0、6、12、24、36、48小时随机分6小组,每组6只。手术前5-10分钟从股静脉注射活血化瘀中药0.5ml∕0.1kg,活血化瘀中药为血必净由天津红日药业生产,其主要成份:红花、赤芍、丹参、当归、川芎。2、动物模型制作:所有手术采取配对方式进行。手术采用4%水合氯醛0.875ml∕0.1kg腹腔注射麻醉,剑突至耻骨联合正中切口。开腹游离左、右肾,充分显露肾蒂,无损伤动脉夹夹闭肾蒂阻断肾血流45min后,松开动脉夹。手术过程中观察肾脏颜色变化,夹闭成功后肾脏颜色变成暗红至暗黑色,打开动脉夹则短时间内迅速再灌注充血恢复为鲜红色。3、标本取材:(1)造模前10分钟及缺血再灌注结束时取血待测肌酐、尿素氮。(2)根据不同再灌注时间点结束时取一侧肾放于液氮罐中保存,后放于-80℃冰箱待免疫印迹检测使用;另一侧肾立即置于10%福尔马林溶液固定24小时,常规石蜡包埋,存于-4℃冰箱待做HE染色病理切片及免疫组化使用。4、结果检测:(1)检测A、B、C三组造模前及不同再灌注时间点的血肌酐及尿素氮的变化。(2)病理切片HE染色光镜及电镜照片。(3)利用免疫印迹方法定量检测各实验组不同再灌注时间点HSP70的表达。(4)免疫组织化学方法定性检测各实验组不同再灌注时间点HSP70的表达。结果1、血肌酐及尿素氮:A组与B组再灌注6小时以上组肾功能改变差异显著(p<0.05),表明肾缺血再灌注损伤后出现急性肾功能不全;A组与C组差异不显著(p>0.05),表明肾缺血再灌注损伤后中药干预组肾功能破坏不显著;B组与C组再灌注6小时以上组差异显著(p<0.05),表明活血化瘀中药有对抗肾缺血再灌注损伤并保护肾功能的作用。2、病理切片HE染色光镜及电镜照片:B组与A组对比表明,肾缺血再灌注损伤后肾脏病理改变明显;C组与B组及A组对比肾缺血再灌注损伤后肾脏病理改变减轻,表明活血化瘀中药减轻了肾脏病理损害。3、免疫组化法定位:可见C组HSP70在细胞浆表达量较B组显著。4、Western blot结果:与A组对比B、C组HSP70的表达随再灌注时间延长而不断增加, B组HSP70在再灌注24h表达达到高峰,C组HSP70表达在再灌注12h较B组提前达到高峰,表明活血化瘀中药诱导HSP70表达提前达高峰发挥保护作用。结论1、正常肾脏组织少量表达HSP70。2、缺血再灌注损伤后肾脏组织HSP70的表达显著增加,免疫组化试验定位表明其主要在细胞浆表达。3、B组和C组HSP70的表达分别在缺血再灌注后24小时和12小时显著增加。4、活血化瘀中药干预组HSP70表达提前显著升高,提示可能引发了内源性保护机制,为临床上早期预防急性肾功衰竭发生和寻找肾缺血再灌注损伤的药物治疗提供重要的理论依据。