目的:肺癌(lung cancer)是当今世界发病率排名最高的恶性肿瘤,同时也是死亡率最高的肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发病率占比80%,其中67%的非小细胞肺癌经检测为YAP高表达,针对非小细胞肺癌病例的研究发现,YAP的表达高低直接与肺癌TNM分期相关,同时也与肺癌的淋巴结转移有显著相关性。中药酸枣仁具有抗惊厥作用,中医常用于治疗失眠。近年来流行病学研究发现酸枣仁中的皂苷具有一定的抗肿瘤作用,并且罕有副作用报道。酸枣仁皂苷A来源于中药酸枣仁,是酸枣仁中主要的皂苷成分,体外研究表明,酸枣仁皂苷A可以引起肺癌细胞的衰老、凋亡以及增殖抑制,但是不影响正常细胞。进一步研究表明,酸枣仁皂苷A的抗肿瘤作用主要是来源于HIPPO通路的激活,从而导致其下游靶点蛋白YAP入核减少。而该通路的激活,是基于酸枣仁皂苷A直接作用于细胞膜表面的Fat4蛋白,激活Fat4蛋白。然而,尚未有文献报道过酸枣仁皂苷A针对肺癌的治疗作用及机制,而Fat4蛋白也尚未报道存在激活剂。基于研究现状,本文还采用了乌拉坦诱导肺癌小鼠的模型来评价酸枣仁皂苷A对于肺癌的化学预防作用,并在体外实验中阐明了其预防肺癌相关机制以及通路。方法:1.考察酸枣仁皂苷A对NSCLC的活力以及检测YAP表达的影响采用商业化的NSCLC细胞系A549、H1299和H1975细胞和人胚肺成纤维细胞MRC-5作为体外研究模型,经不同浓度酸枣仁皂苷A(0-500 μM)给药2-5天后,以MTT法检测酸枣仁皂苷A对细胞系活力抑制作用作用并确定酸枣仁皂苷A给药浓度与给药时间。并通过实时定量PCR(Real-time PCR)以及Western blot检测YAP表达水平。2.酸枣仁皂苷A对A549肺癌细胞YAP蛋白表达以及HIPPO通路的调控研究基于MTT实验,确定体外实验给药浓度,利用Western blot检测酸枣仁皂苷A对肺癌细胞YAP上游的HIPPO通路蛋白,并采用蛋白热转移实验验证酸枣仁皂苷A对HIPPO初始启动蛋白Fat4的激活作用。3.酸枣仁皂苷A对YAP原癌基因下游相关信号通路以及功能学研究针对于酸枣仁皂苷A作用于HIPPO通路,我们针对HIPPO中关键蛋白YAP的下游进行了相关检测。其中我们检测了干性、衰老、增殖和凋亡相关的蛋白以及功能学,运用到了流式细胞术、EdU检测以及激光共聚焦显微镜等实验方法。4.考察下调Fat4蛋白后酸枣仁皂苷A对H1975细胞功能学的改变运用小干扰RNA技术对高表达Fat4蛋白的H1975进行Fat4蛋白的下调,并且对下调Fat4蛋白后的细胞进行给药并检测其干性、衰老、增殖和凋亡,运用到了流式细胞术、EdU检测以及激光共聚焦显微镜等实验方法。5.酸枣仁皂苷A对肺癌动物模型化学预防作用的机制研究实验采用乌拉坦诱导肺癌动物模型,经5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg酸枣仁皂苷A给药22周,考察酸枣仁皂苷A在肺癌形成过程中的化学预防作用。记录动物体重变化,体视镜计数肺部肿瘤结节数量,HE染色检查肺部病理改变,免疫组化检测肺部YAP蛋白表达变化,流式细胞仪检测外周血单核细胞(PBMC)中巨噬细胞的分型。6.统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,多组间均数比较采用One way ANOVA,P<0.05表示具有显著学差异。采用GraphPad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean ± SD 表示。结果:1.酸枣仁皂苷A显著抑制肺癌细胞活力,显著降低YAP蛋白表达水平经酸枣仁皂苷A给药2-5天后,酸枣仁皂苷A对NSCLC细胞表现出显著的抑制作用。根据MTT检测结果,保证80%以上细胞可存活,因此确定酸枣仁皂苷A给药浓度为0,25,50,100 μM,给药时间5天。2.酸枣仁皂苷A可通过结合Fat4蛋白,激活HIPPO通路实验结果显示,酸枣仁皂苷A可以通过与Fat4结合,激活HIPPO通路,从而下调YAP蛋白表达。3.酸枣仁皂苷A抑制YAP下游信号通路结果表明,酸枣仁皂苷A给药后,由于HIPPO通路的激活,YAP的减少,导致与YAP相关的下游通路均被调控,肺癌细胞经过给药后经β半乳糖苷酶染色和衰老相关异染色质聚集发现了衰老现象、并且衰老相关的p16等蛋白升高;通过流式细胞仪检测CD133/CD44表面标志物,发现肺癌细胞干性程度降低、干性标志物蛋白Nanog等下调;通过EdU检测、平板克隆以及流式检测细胞周期,发现肺癌细胞增殖能力下降、增殖相关周期蛋白CyclinD1等下调;通过流式检测细胞凋亡,发现肺癌细胞凋亡增多,凋亡相关的Caspase家族蛋白上调。4.抑制Fat4的表达可以逆转酸枣仁皂苷A对HIPPO通路的激活下调Fat4的表达后,酸枣仁皂苷A不能再对NSCLC细胞的衰老、增殖、凋亡和干性有明显的功能学改变。5.酸枣仁皂苷A体内化学预防肺癌作用评价及机制研究在乌拉坦诱导肺癌动物实验中,酸枣仁皂苷A能显著降低肺癌结节的产生率,酸枣仁皂苷A给药组体重明显重于对照组;另外,脾脏指数和胸腺指数表明酸枣仁皂苷A能增强动物的免疫能力;免疫组化的结果显示酸枣仁皂苷A能显著降低肺部细胞核内YAP的表达量;同时外周血中单核细胞更多的向M1型巨噬细胞分化。结论:本文将对酸枣仁皂苷A抑制NSCLC的作用及分子机制进行研究,探索该药物体内外相关的作用机制,发现酸枣仁皂苷A可能通过与Fat4膜蛋白结合,从而激活HIPPO通路降低恶性癌蛋白YAP的表达,随着YAP蛋白表达的下降,YAP下游与肿瘤增殖、抗凋亡和干性的相关基因均下调,从而阻滞肿瘤细胞周期,诱导肿瘤细胞凋亡,降低肿瘤细胞干性。另外,酸枣仁皂苷A还可能通过激活免疫能力来降低肿瘤发生情况,因此,本研究可为酸枣仁皂苷A用于肺癌化学预防提供一定理论依据。