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背景肌钙蛋白(Troponin)是调节横纹肌收缩的蛋白复合物,存在于细肌丝中,由肌钙蛋白Ⅰ(Troponin I, TnI)、肌钙蛋白T (Troponin T, TnT)和肌钙蛋白C(Troponin C, TnC)三个亚基组成。肌钙蛋白I(Troponin I, TnI)作为该复合物的抑制性亚基,具有抑制肌动球蛋白Mg2+-ATP酶的作用。哺乳动物有三种不同基因编码的TnI亚型,分别称为慢骨骼肌亚型(TNNI1)、快骨骼肌亚型(TNNI2)和心肌亚型(TNNI3)。人类TNNI3基因位于19q13.4,编码约由210个氨基酸组成的蛋白质(24kDa)。与快、慢骨骼肌型TnI氨基酸序列相比,心肌型TnI蛋白(cTnI)在N端另延伸出30个氨基酸残基,使之具有较高的心肌特异性。cTnI以不同形式存在于心肌细胞中,约3%-8%的cTnI分布于心肌细胞胞浆,为游离的胞浆蛋白,大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。近期已有实验研究证实心肌肌钙蛋白I在心肌细胞核中也有分布。心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponin I, cTnI)对诊断心肌损伤具有较高的特异性和敏感性,近年来逐渐取代肌酸激酶同工酶CK-MB,成为判断心肌细胞损伤的金标准。临床上,对于肿瘤病人而言,一系列抗肿瘤治疗如放疗、化疗以及生物治疗等导致的心脏损伤也可通过血清cTnI进行检测和评估。传统观点认为生理情况下cTnI仅在心肌组织中表达,最近有文献报道发育中的骨骼肌一过性表达cTnI。cTnI有高度心肌特异性。迄今为止,没有相关文献资料证实cTnI存在于非肌性细胞中,包括肿瘤细胞。本研究旨在探索人肿瘤组织及肿瘤细胞株中cTnI的表达情况,为研究cTnI与肿瘤的关系及机制提供实验依据。目的研究人非小细胞肺癌组织及肿瘤细胞株中心肌肌钙蛋白Ⅰ的异常表达。方法1.抗人cTnI单克隆抗体的表位鉴定本实验室采用经典杂交瘤方法制备抗人cTnI单克隆抗体(Monoclonal antibody, mAb)三株XY15、XY13及XY10。以纯化后的人cTnI (hcTnI)及合成的cTnl肽段(scTnI-P)为抗原,通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)及免疫印迹法(Western blot)鉴定mAbs的识别部位及特异性。使用同样方法鉴定Dr. Jack H. Ladenson教授赠送本实验室的抗人cTnI单抗2F6.6表位。另外,在本研究中使用的其他三株抗人cTnI单抗19C7、16A11、84(表位41-49、86-90、117-126)购自Hytest公司。2.检测cTnI在人非小细胞肺癌组织中的表达本研究室病理标本库中43例非小细胞肺癌和6例其他肺部疾病患者手术切除的组织,于2007-2008年收集于南京军区总医院心胸外科和呼吸内科。病理学诊断肺鳞癌(21例),肺腺癌(17例),肺腺鳞癌(3例),大细胞肺癌(2例),肺转移性肉瘤(1例),肺结核(3例),肺硬化性血管瘤(1例)和肺炎性假瘤(1例)的病人。在采集标本前,所有患者未接受化疗、放疗或免疫性治疗。用免疫组织化学方法,选用抗人cTnI单抗2F6.6和19C7,检测病理组织中cTnI的表达,根据染色强度分为0(阴性),1(弱阳性),2(中等度阳性),3(强阳性)四级。3.检测cTnI在人肿瘤细胞株中的表达培养人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823及肝癌细胞株Huh-7、MHCC-97L和MHCC-97H。选用上述7株抗人cTnI单克隆抗体,免疫荧光法检测细胞株cTnI的表达及细胞定位。4.人肿瘤细胞株中cTnI mRNA的表达用Trizol试剂盒提取人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823及心肌细胞总RNA。Real-time PCR法比较肿瘤细胞株与心肌细胞cTnI mRNA表达量。目的基因是TNNI3,内参基因是GAPDH,以2-ΔΔCt方法计算。5.人肿瘤细胞株中cTnI蛋白表达用细胞裂解液提取人肺腺癌细胞株SPCA-1、人胃腺癌细胞株BGC823及心肌细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。Western blot法检测cTnI蛋白表达。结果1.利用酶联免疫吸附法以及免疫印迹法鉴定四株抗人cTnI单克隆抗体XY15、XY13、XY10及2F6.6的表位分别是56-80、76-110、181-210、13-36。其中抗体XY15的亚型为IgG2b,抗体XY13、XY10的亚型为IgGl。2.利用免疫组织化学方法检测人非小细胞肺癌组织中cTnI表达,发现69.4%(34/49)呈阳性,其中35.3%(6/17)肺鳞癌患者呈强阳性,而非癌、非结核组织(9/9,100%)呈阴性。cTnI阳性分布可呈大片状、聚集性或散在性。3.利用免疫荧光化学方法检测人肺腺癌细胞株SPCA-1和人胃腺癌细胞株BGC823,结果呈阳性,并具有表位控制特点,抗cTnI N-端抗体着色于肿瘤细胞的胞膜及核仁,而抗cTnI中间端及C-端抗体着色于胞浆,同样的方法检测人肝癌细胞株Huh-7、MHCC-97L和MHCC-97H也有类似的表达方式。同时免疫荧光观测肿瘤细胞株细胞核有cTnC表达,而培养心肌细胞cTnI与cTnC共表达于细胞浆,内皮细胞无cTnI与cTnC表达。4. Western blot法证实与阳性对照组比较,人肺腺癌细胞株SPCA-1和人胃腺癌细胞株BGC823的细胞蛋白提取液均见～25kDa条带。Real-time PCR法证实BCG823细胞及SPCA-1细胞中cTnI mRNA的表达量分别为心肌细胞的1.0×10-4和1.8×10-4。收集Real-time PCR产物后行琼脂糖凝胶电泳证实,BGC823细胞及SPCA-1肿瘤细胞组泳道在250bp处出现单一条带,与阳性对照组一致,而阴性对照组无条带出现。结论1.人非小细胞肺癌组织中异常表达心肌肌钙蛋白Ⅰ,分布可呈大片状、聚集性或散在性。2.多种人肿瘤细胞株中普遍表达心肌肌钙蛋白Ⅰ,分布在细胞膜、胞浆及细胞核。肿瘤细胞株细胞核中cTnI-cTnC共存,其cTnI mRNA表达量约为心肌细胞的万分之一。Western blot可见～25kDa条带。