结直肠癌是世界范围内最常见的肿瘤之一,其发生发展的分子机制一直是研究热点。针对肿瘤代谢的分子机制进行深入研究以及据此设计出的显像剂和/或制定的逆转策略(靶向治疗)将对诊断、治疗和早期判断临床疗效的意义深远。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase, Nampt)和葡萄糖都是恶性肿瘤特性之一的有氧糖酵解中的关键因子,我们将分别对他们的基础分子机制和临床应用进行探讨。本研究中通过Nampt的抑制剂 FK866来初步探讨 Nampt在结直肠癌细胞生长、增殖中发挥的作用。同时我们还将预测和验证miR-26b调控Nampt,以及通过研究miR-26b和Nampt在多种结直肠癌细胞和人新鲜癌组织中的表达情况进一步证实。另外,我们还初步探讨一下miR-26b对结直肠癌细胞生长、增殖和侵袭力的影响,从而为结直肠癌的治疗提供新的策略和靶点。本研究分为五个部分：　　第一部分Nampt对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。本部分将探讨尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)在人结直肠癌细胞中能量代谢异常中的作用,为未来分子影像和/或靶向治疗提供关键基础研究。采用不同浓度的Nampt的抑制剂 FK866对人结直肠癌细胞株SW480和LoVo进行干预,使用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8, CKK-8)检测干预后的细胞活力;使用Annexin V/PI检测干预后的细胞凋亡情况;使用NAD+/NADH定量试剂盒检测干预后对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)产生的影响。研究表明，FK866对SW480和LoVo细胞株的半抑制浓度(50％inhibitor concentration,IC50)分别为14.3 nmol和32.7 nmol。随着FK866浓度的增加,人结直肠癌细胞凋亡比率增高(SW480 vs LoVo:3.37+0.83%vs3.0+0.37%;10.67+1.08%vs8.9+0.98%;27.27+1.49%vs21.53+1.76%);并且细胞中NAD含量下降(SW480 vs LoVo:5.33+0.96 vs6.63+1.16 nmol/μg,1.93+0.49 vs3.16+0.31 nmol/μg,1.17+0.31 vs2.33+0.85 nmol/μg)。这些结果说明,Nampt抑制剂FK866对结直肠癌细胞株SW480和LoVo有抗增殖和促凋亡作用,具体机制有待进一步研究。　　第二部分预测和验证miR-26b靶向调控Nampt。通过生物信息学对调控 Nampt的miRNA进行预测,结合miRNA的本身生物学功能和已发表的文献结果,确定研究靶基因。其次,将不同浓度miR-26b模拟物或抑制剂加入SW480细胞中进行培养,运用qRT-PCR检测细胞中 Nampt的mRNA表达情况,同时使用Western-blot检测细胞株中Nampt的蛋白表达差异,从而确定miR-26b调控Nampt的mRNA和蛋白表达。最后,使用双荧光素报告酶进一步验证miR-26b的直接调控Nampt,方法如下:根据miR-26b结合Nampt的3’UTR位点,构建相应的报告基因载体及突变体,同时测序确定构建成功;将所构建的报告基因载体/突变基因载体和不同浓度的miR-26b模拟物共转染至SW480细胞中,24 h后检测报告酶变化。研究表明，首先结合信息学方法,生物学功能和文献报道,预测miR-26b可能是调控Nampt的上游miRNA之一。其次,研究发现miR-26b调控Nampt的改变:随着miR-26b的模拟物浓度的增加,SW480细胞株中Nampt的mRNA和蛋白表达逐渐下调;随着 miR-26b的抑制剂浓度的增加,SW480细胞株中Nampt的mRNA和蛋白表达逐渐上升。最后,双荧光素报告酶试验验证了miR-26b直接结合在Nampt的3’-非翻译区:针对于Nampt的miR-26b报告基因,荧光酶检测发现随着miR-26b模拟物浓度的增加,荧光酶表达逐渐降低且变化有显著性意义(p<0.01);而针对于Nampt的miR-26b突变基因的报告酶表达变化不显著(p>0.05)。这些结果说明,我们成功预测和验证了miR-26b通过结合在Nampt的3’UTR位点,靶向负性调控Nampt的mRNA和蛋白表达。　　第三部分在结直肠癌细胞、新鲜人结直肠癌/癌旁组织中验证 miR-26b和Nampt表达情况。使用qRT-PCR方法,观察五种结直肠癌细胞中miR-26b和Nampt的mRNA表达情况,同时比较人新鲜结直肠癌/癌旁组织中的miR-26b和Nampt的mRNA表达情况,从而在结直肠癌细胞和新鲜人组织标本中进一步验证两者之间的关系。研究表明，使用qRT-PCR方法,检测到五种结直肠癌细胞株(SW480,SW1116,HT-29,LoVo,HCT116)中miR-26b和Nampt的mRNA相对含量成反比,两者在统计学上存在显著相关性(r=-0.967,p=0.007)。18例结直肠癌患者的结直肠癌/癌旁组织中miR-26b与Nampt的mRNA含量成反比,两者统计学上存在显著相关性(癌vs癌旁组织:r=-0.8903 vs-0.9382, p<0.0001vs p<0.0001);两者miR-26b含量相比,癌旁组织大约是癌组织中的2.2倍(癌vs癌旁组织:0.025+0.012 vs0.055+0.009,p<0.001);而Nampt的mRNA含量,癌旁组织大约是癌组织中的15.85%(癌vs癌旁组织:0.940+0.309 vs0.149+0.061,p<0.001)。这些结果说明:miR-26b和Nampt在五种人结直肠癌细胞、新鲜人结直肠癌/癌旁组织中都呈显著负相关;人结直肠癌标本中存在miR-26b含量下降,Nampt含量上升的现象。进一步验证了miR-26b和Nampt之间的关系。　　第四部分 miR-26b靶向作用Nampt/NAD信号通路对结直肠癌细胞生长和侵袭的影响。将不同浓度的miR-26b的模拟物或抑制剂、NAD加入到结直肠癌细胞中,通过CCK-8试验检测细胞增殖情况,流式细胞术 Annexin V/PI检测相应的细胞凋亡情况和细胞侵袭试验观察其对结直肠癌细胞株侵袭力的影响,初步探讨miR-26b在结直肠癌细胞中的潜在作用。研究表明，CCK-8试验结果发现 miR-26b模拟物干扰结直肠癌细胞的效果最佳;miR-26b抑制剂显著促进结直肠癌细胞增长;miR-26b模拟物联合NAD后可以部分逆转单独使用miR-26b的抗增殖作用。细胞凋亡检测发现:在不同浓度miR-26b的模拟物干预下,细胞凋亡率增高(阴性对照组:7.33±0.60%;30nmol/L:13.5±1.15%;60nmol/L:24.2±0.79%);不同浓度的miR-26b的抑制剂干预下,细胞凋亡率下降(阴性对照组:8.13±0.35%;30nmol/L:5.8±0.36%;60nmol/L:3.03±0.72%);在不同浓度的miR-26b的模拟物和NAD的联合作用下,细胞凋亡率上升(阴性对照组:4.37±0.75%;30nmol/L:10.07±0.67%;60nmol/L:12.23±0.35%)。综上,miR-26b模拟物联合NAD后可以部分逆转单独使用相同浓度模拟物的促凋亡作用。细胞侵袭试验显示:miR-26b抑制剂显著增加结直肠癌细胞的侵袭力(是阴性对照组的1.7倍),miR-26b模拟物显著降低细胞侵袭力(是阴性对照组的34.53%),但当加入 NAD时可以部分缓解miR-26b的模拟物的抗侵袭作用(是阴性对照组的66.10%)。这些结果说明:miR-26b有降低结直肠癌细胞活力、促进细胞的凋亡,减弱细胞侵袭力的抗肿瘤作用;加入 NAD后可以部分逆转 miR-26b抗肿瘤的作用。　　第五部分使用18F-FDG PET判断直肠癌和非小细胞性肺癌新辅助治疗的疗效。以直肠癌或非小细胞性肺癌、FDG、PET等为检索词,检索1966年1月至2012年7月的Medline数据库等相关英文文献,对符合标准的研究进行质量评估,用MetaDisc1.4和Stata software10.0软件进行异质性检验,计算综合敏感性、特异性分析以及亚组分析。进而,探讨PET在直肠癌和非小细胞性肺癌中,对新辅助治疗疗效的评价效果,从而进一步为临床新辅助治疗提供帮助。研究表明，第一、对直肠癌进行分析时,共计28篇1204名患者入选。FDG-PET预测新辅助治疗的疗效的汇总敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别是78%(95%CI,75%-82%),66%(95%CI,62%-69%),70%(95% CI,66%-73%)和75%(95% CI,71%-79%)。通过亚组分析,疗效指数(response index,RI),标准化摄取值(the standardised uptake value,SUV)和视觉评分(the visual response score,VRS)之间差异,无显著性意义。然而,在治疗中使用PET评价疗效的敏感度和特异度(敏感度86%,特异度80%)显著高于治疗后。第二、对非小细胞性肺癌进行分析时,共计13篇414名患者入选。FDG-PET预测新辅助治疗的疗效的汇总敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别是83%(95%CI;76%–89%),84%(95%CI;79%–88%),74%(95%CI;67%–81%), and91%(95% CI;87%–94%)。通过亚组分析,PET评价疗效的敏感度和特异度显著高于CT(p<0.05)。这些结果说明:18F-FDG PET能灵敏、早期、准确地判断直肠癌的新辅助治疗疗效;其对非小细胞性肺癌的疗效评价比CT更高,具有较高的临床应用价值。然而,这些结论还需要大量前瞻性临床试验验证。