锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus[KHV]),2005年重新命名为鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3),属于Allloherpesviridae科,自然宿主为普通鲤鱼和锦鲤,死亡率高达80%-100%。1998年报道至今,短短十几年,除了北非,全世界都有KHVD暴发引起大面积鲤鱼死亡的报道。因此,KHV已成为全球进出口贸易重点检测对象,KHV疾病也是OIE要求必须上报的重大疾病,我国农业部将其定为Ⅱ类动物疫病。KHV致病性强,发病急,死亡率高,传播速度快,严重威胁着鲤鱼和锦鲤养殖业的发展,给全世界的淡水养殖业造成了巨大的经济损失。锦鲤疱疹病毒感染的表现形式可以分为急性感染和潜伏感染。急性感染时,病毒大量复制,表现为锦鲤疱疹病毒病临床症状。潜伏感染时,病毒以非整合状态的基因组形态游离在宿主细胞核内,一定条件下病毒可重新被激活引起宿主临床症状并导致死亡,这是导致KHV呈世界性流行和快速传播的一个重要原因。因此,建立快速准确检测KHV的方法在防控疾病的流行和传播中具有重要意义。本研究从四川某鲤鱼养殖场暴发的传染病中分离得到一株KHV病毒,并且进行了系统进化分析。针对KHV急性感染和潜伏感染的表现形式,建立了快速的检测方法,并且了进行初步应用,为KHVD的流行病学调查和预防提供了实验基础。具体研究内容分为三个章节,概述如下:1.四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析2015年5月,四川某鲤鱼养殖场暴发一种传染性疾病,导致大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、组织病理学观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学上,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀,脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测KHV的Sph基因进行PCR检测,出现的特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤鱼,试验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤鱼脑细胞系(CCB)后,盲传3代后可见典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球形病毒,病毒粒子直径为180～200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究报道了我国西南地区养殖鲤鱼中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要基础。2.锦鲤疱疹病毒急性感染快速检测方法的建立和应用为了建立一种快速、准确、适合临床应用的KHV急性感染的检测方法,我们选用了环介导等温扩增PCR(LAMP)。根据GenBank中KHV的Sph基因序列,设计了 LAMP特异性引物,并通过oligo软件设计了可以提高LAMP反应速率的环引物,确定最佳反应条件后,进行了特异性、灵敏度分析,并在临床中做了初步研究。本实验建立的LAMP检测方法,与KHV基因亲缘关系较近的鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒Ⅰ型(CyHV-1)和鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)均无交叉反应,特异性强。最低检出率为13.9copies/μL,灵敏度高。使用LAMP和普通PCR方法,采用非致死性(鳃拭子)采样方法对四川五个地区的鲤鱼和锦鲤养殖场进行了临床检测,阳性率为31.40%(27/86)。本实验建立了一种高灵敏度、高特异性、快速简便的CyHV-3急性感染检测方法,适用于临床上对KHVD的快速诊断。3.锦鲤疱疹病毒潜伏感染检测方法的建立和应用为建立一种特异和敏感的检测KHV潜伏感染的方法,以KHVSph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了 Real-time PCR,并且对该方法进行了特异性和敏感性评估及临床样品的初步应用研究。结果显示,本研究建立的方法与CyHV-1、CyHV-2和AngHV均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42copies/uL,灵敏度高。使用RT-PCR和LAMP方法对63份临床样品进行检测,有过锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品,检测结果全为阳性,阳性率为100%(18/18);从有临床症状的鱼中得到的15份样品,检测全为阳性,阳性率为100%(15/15);无任何临床症状鱼中得到的30份样品,6份检测为阳性,阳性率为20%(6/30)。本试验在国内建立并报道水生动物疱疹病毒潜伏感染的快速检测方法,为临床上检测潜伏感染的KHV提供了一种快速、敏感和特异的手段,为KHVD的分子流行病学调查和预防提供了相应的技术支持。