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组织蛋白酶D(cathepsin D, CTSD)是真核细胞溶酶体中天冬氨酸水解酶家族的主要成员，广泛参与蛋白质的水解过程。近年的研究发现，CTSD在多种生理（细胞增殖、细胞凋亡、细胞衰老和组织内稳态）和病理（阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、先天性肌肉萎缩和癌症）条件中均发挥重要作用，并因其生物学功能的多样性而受到广泛关注。成体七鳃鳗主要营半寄生生活，以吸食宿主血肉为生，因其作为连接脊椎动物与无脊椎动物间的纽带而具有极高的研究价值。长久以来，七鳃鳗不仅是研究脊椎动物起源与进化的关键物种，同时也是研究脊椎动物胚胎发育和器官分化的最佳模型，在世界动物学研究史上一直占据着举足轻重的地位。目前对CTSD的研究主要集中在高等脊椎动物，而对其在相对比较原始的无颌类脊椎动物中的生物学功能，还尚不明确。本研究通过对实验室前期构建好的七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文库中的3500多条有效EST序列进行搜索，获得一条与CTSD家族基因高度同源的EST序列。通过分子克隆手段，成功获得七鳃鳗CTSD基因(lamprey cathepsin D, L-CTSD)的cDNA全长序列1790bp，其中3’非编码区472bp，5’非编码区124bp，开放阅读框1194bp，共编码396个氨基酸。通过生物信息学分析，发现L-CTSD基因编码的氨基酸序列由信号肽(Met1-Ala20)、前体域(Thr21-Ala48)和成熟域(Gln76-Val396)三部分组成，含有一个潜在的N糖基化位点(Leu53)。氨基酸序列比对结果表明L-CTSD基因编码的氨基酸序列与尖吻鲈CTSD的氨基酸序列同源性高达70%，系统发育树结果表明七鳃鳗CTSD与爬行类、哺乳类CTSD的亲缘关系最近，符合从低等到高等、由简单到复杂的进化规律，但又自成一枝，具有独特的进化地位。利用实时定量PCR(Real-time quantitativePolymerase Chain Reaction, Real-time PCR)的方法，发现L-CTSD基因广泛分布于七鳃鳗的口腔腺、鳃、心脏、肝脏、肠、肾脏和免疫小体中。实验组七鳃鳗经大肠杆菌(Escherichiacoli, E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus, S.aureus)抗原刺激后，以上组织中L-CTSD基因的相对表达水平发生了明显上调，推测七鳃鳗CTSD可能与其营养摄取、免疫逃逸、个体发育等生理过程密切相关。进一步构建了原核表达载体pColdⅠ-CTSD，并在E.coli BL21中成功表达，通过组氨酸亲和层析柱纯化，获得电泳较纯的重组蛋白rL-CTSD(recombinant L-CTSD, rL-CTSD)。L-CTSD基因的成功克隆表达，为下一步阐明CTSD在七鳃鳗体内的生物学功能奠定了坚实的理论和物质基础，同时也为研究脊椎动物的起源和进化做了重要的前期准备。