近年来,随着人们的生活水平不断提高,消费者对肉类产品质量的要求也越来越高。肉质性状指标包括色泽、质地、硬度、嫩度、大理石纹等特征,其中,肌内脂肪含量是评价牛肉品质的一项重要指标。肉牛肌内脂肪沉积包含脂肪细胞和组织内部的脂滴积累、消耗及脂肪酸代谢的动态平衡过程,与脂肪细胞分化密切相关,并受一系列与脂肪细胞分化相关的转录因子调控。PPARγ作为促进脂肪细胞分化和多种基因转录调控的重要因子,在牛脂肪细胞的诱导分化及脂肪酸代谢中发挥极其重要的作用。延边牛是我国五大地方良种肉牛之一,具有肉质性状与韩牛、日本和牛相媲美的培育潜力。为深入了解延边牛脂肪组织中前体脂肪细胞的生物学特性和相关调控机制,为今后的延边牛分子育种工作与脂肪代谢调控提供重要参考,本研究以油酸和环格列酮作为激动配体调控PPARγ基因表达,通过单独诱导和共同诱导延边牛前体脂肪细胞分化,旨在阐明其对延边牛脂肪细胞分化作用的影响与相关作用机制,明确差异表达基因,进一步阐明关键信号通路中主要差异表达基因的变化规律与相互作用关系。具体研究结果如下:1.油酸对延边牛前体脂肪细胞分化的影响及相关作用机制的研究利用胶原酶消化法成功分离了 18月龄延边牛前体脂肪细胞进行体外培养,用100μMol/L油酸对细胞进行诱导分化,研究油酸对脂肪细胞分化的作用,对分化48h和96 h的细胞进行转录组学研究,并利用不同浓度(0,0.25,0.5,1,2和4 μMol/L)PPARγ抑制剂GW9662,进一步验证PPARγ对延边牛前体脂肪细胞分化的影响及作用机制,结果表明:1)经油酸诱导后24 h便可观察到脂滴形成,120 h时几乎分化完全;2)随处理时间增加甘油三酯浓度增加,分化96 h时达到最高(P<0.05),120 h时略降低但始终高于对照组(P<0.05);3)经油酸诱导后,成脂相关基因 PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β SREBP1 及 PLIN2的表达随处理时间不同表现出不同的变化趋势,PPARγ、C/EBPα、CPT1β、SREBP1、FABP4和PLIN2基因的表达量在不同分化时间始终高于对照组(P<0.05),LPL基因的表达短暂下降后逐渐上升(P<0.05),只有SCD基因的表达始终低于对照组(P<0.05);4)根据转录组测序结果,分化48 h时,共有3926个差异基因(2263个上调基因和1663个下调基因),分化96 h时,共有7445个差异基因(7088个上调基因和357个下调基因);5)分化不同时间差异基因的分子功能,参与的生物过程和细胞组成均发生变化,差异基因参与的主要生化代谢途径和信号转导途径有较大差异;6)根据油酸对脂肪细胞PPAR信号通路的调控结果,与对照0h相比,分化48、96 h时,PPARγ的表达上调,信号通路成员CPT1β,FABP4、PLIN2、SREBP1上调,SCD表达下调;与分化48 h相比,分化96 h组PPARγ、SCD的表达显著下调,CPT1β,、PLIN2、SREBP1显著上调,FABP4表达无显著变化;7)随着抑制剂浓度的增加,PPARγ的表达不断下降,甘油三酯浓度和牛脂联素的分泌不断下降(P<0.05),FABP4、CD36、PLIN2和ADP等基因的相对表达量下降(P<0.05)。2.环格列酮对延边牛前体脂肪细胞分化的影响及相关作用机制的研究用10μg/mL环格列酮对延边牛前体脂肪细胞进行诱导分化,研究环格列酮对前体脂肪细胞分化的作用,并对分化48 h和96 h的细胞进行转录组学研究,结果表明:1)分化72h可观察到脂滴形成,甘油三酯浓度不断升高,144h达到最高(P<0.05);2)经环格列酮诱导后,成脂相关基因PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREB1及PLIN2的表达表现不同的变化趋势,其中,PPARγ、FABP4、CPT1β和SREBP1的表达量始终高于对照组(P＜0.05),C/EBPα、LPL、SCD和PLIN2基因的表达先降后升,除SCD基因的表达始终低于对照组外,C/EBPα、LPL和PLIN2基因的表达在48 h时达到最低后逐渐升高,144 h时显著高于对照(P<0.05);3)根据转录组测序结果,分化48 h时,共有1282个差异基因(687个上调基因和595个下调基因),分化96 h时,共有6172个差异基因(5708个上调基因和464个下调基因);4)分化不同时间差异表达基因的分子功能,参与的生物过程和细胞组成均发生变化,差异基因所参与的主要生化代谢途径和信号转导途径也有差异;5)根据环格列酮对脂肪细胞PPAR信号通路的调控结果,处理48 h时,可调控通路中ACSL6、NR1H3、MMP1、PLIN1、CPT1B,FABP4,ANGPTL4,GK和CD36基因表达上调,SCD表达下调;分化96 h时,包括SLC27A1、SLC27A4、ACSL1、SCD5,CPT1A、CPT1B,ANGPTL4、PLIN2、MMP1、PCK1和CD36在内的11个基因表达上调,未检测到下调基因。3.油酸和环格列酮影响延边牛前体脂肪细胞分化比较研究通过比较不同处理(100 μMol/L油酸、10 μg/mL环格列酮、100 μMol/L油酸+10 μg/mL环格列酮)在不同分化时间对前体脂肪细胞分化的影响及转录组学研究表明:1)分化48 h时,油酸单独诱导及油酸和环格列酮共同诱导均可促进脂滴生成;对甘油三酯浓度的影响为油酸>油酸+环格列酮>环格列酮;差异表达基因数量油酸(3926)>油酸+环格列酮(2957)>环格列酮(1282);各处理组均可上调ACSL6、FABP4、ANGPTL4、GK和CD36基因的表达,下调SCD基因的表达。2)分化96 h时,不同处理组均可生成脂滴;对甘油三酯浓度的影响为油酸+环格列酮>油酸>环格列酮,均高于对照组;差异表达基因数量油酸和环格列酮(7499)>油酸(7445)>环格列酮(6172);差异表达基因的分子功能,参与的生物过程和细胞组成,主要生化代谢途径和信号转导途径均有差异,各处理组均可上调CPT1A、ANGPTL4、MMP1、PLIN2、PCK1和CD36基因的表达。4.油酸和环格列酮共同诱导对延边牛前体脂肪细胞分化进程的影响用10 μg/mL环格列酮+100 μMol/L油酸对延边牛前细胞进行诱导分化,研究油酸和环格列酮对前体脂肪细胞分化的作用,并对分化48h和96h的细胞进行转录组学研究,结果表明:1)诱导后48 h可观察到脂滴形成;2)随处理时间增加甘油三酯浓度升高,显著高于对照组(P<0.05);3)成脂相关基因PPARγ、C/EBPα、LPL、FABP4、SCD、CPT1β、SREBP1及PLIN2的表达随处理时间不同表现出不同的变化趋势,PPARγ、C/EBPα、FABP4、PT1β、SREBP1及PLIN2的表达量在不同分化时间始终高于对照组,SCD基因表达自分化后开始下降,120 h时达到最低(P<0.05),LPL基因在分化初期表达量下降,48 h达到最低,之后不断升高,120 h时表达最高,(P＜0.05);4)根据转录组测序结果,分化48 h时,共有2957个差异基因(1060个上调基因和1897个下调基因),分化96 h时,共有7499个差异基因(6912个上调基因和587个下调基因);5)不同分化时间差异表达基因的分子功能、参与的生物过程和细胞组成,以及参与的主要生化代谢途径和信号转导途径富集有较大差异;6)根据对PPAR信号通路的研究结果,在油酸和环格列酮共同诱导下,分化48 h时,PPARγ、ACSL6、CPT1A、CPT1B、MMP1、PLIN2、FABP4、ANGPTL4、GK和 CD36 上调,SCD 下调;分化 96 h 时,NR1H3、ACSL6,SLC27A4、CPT1A、CPT1B、ANGPTL4、FABP4、PLIN2、MMP1,GK、PCK1、PCK2和CD36表达上调,LPL表达下调。油酸和环格列酮共同诱导对PPAR信号通路中差异表达基因的调控存在时间依赖性或时间特异性作用。5.FABP4对延边牛前体脂肪细胞分化的影响利用油酸促进延边牛前体脂肪细胞分化的同时加入不同浓度(0,2.5,5,10,20和40 μMol/L)的BMS-309403,激活PPARγ促进前体脂肪细胞分化的同时,对FABP4进行抑制,研究FABP4对延边牛前体脂肪细胞分化的影响,结果表明:1)添加不同浓度FABP4抑制剂对FABP4的相对表达量无显著影响;2)添加不同浓度的抑制剂后,各处理组均可生成脂滴,且低浓度处理组细胞内的脂滴数量和密度明显多于高处理组;3)不同处理组的甘油三酯浓度和牛脂联素的分泌随添加浓度的增加不断下降(P<0.05),PPARγ、PLIN2、CD36和ADP基因的相对表达量也下降(P<0.05)。综上所述,通过研究PPARγ激动剂—油酸和环格列酮对延边牛前体脂肪细胞分化过程及转录组学影响,明确了环格列酮和油酸对前体脂肪细胞分化及PPAR信号通路的具体作用机制,为今后分子育种工作中基因调控及PPARγ激动剂的选择提供理论依据,同时也为脂肪细胞分化过程中主要功能基因的研究提供了理论基础。