猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。该病毒基因组为正单股RNA,全长约15kb,含有9个开放阅读框(ORF). PRRSV在自然界中不断的变化,不断有新的毒株出现,随之而来的是给养猪业带来灾难性的损失。虽然世界范围内分离的不同PRRSV毒株引起大体相似的疾病,但是PRRSV不同分离毒株之间存在抗原性、遗传性和致病性方面的差异。2006年在中国大陆地区多省份出现高致病性PRRS,主要临床表现为持续高热(41.0℃以上)、皮肤发红、发病率和死亡率高,对高致病性PRRS测序结果表明,病毒非结构蛋白Nsp2上存在30个氨基酸缺失。为了解目前我国PRRSV的流行情况和不同毒力PRRSV毒株的遗传进化和变异特点,本研究对临床上分离获得的三株流行毒株全基因测序分析,根据基因分析结果,在Marc-145细胞上对NT0801毒株连续传代,并采用商品仔猪分别接种NT0801和NT0801细胞传代毒株以评价该毒株经过细胞连续传代后对仔猪的致病特性的影响,同时将NT0801-F70弱毒株进行攻毒保护试验,具体研究内容和结果分为以下4个部分：1.猪繁殖与呼吸综合征病毒两个不同毒力分离株全基因序列测定和分析为了探讨PRRSV基因变异与毒力的关系,本研究选择高致病性PRRSV变异株BB0907和低致病性PRRSV变异株SY0909分别利用RT-PCR方法分别扩增其包含全基因序列的8条基因片段,克隆于pEASY-Blunt质粒载体进行测序,拼接得到PRRSVBB0907株和SY0909株的全基因组cDNA。结果为：(1) BB0907株和SY0909株基因组全长分别为15361和15369bp,各包含9个开放式阅读框,5’UTR都含有189nt,3’端UTR分别含有191nt、199nt,其中各包含41nt Poly(A)、49nt Poly(A), GenBank为HQ315835, HQ315837.(2)BB0907和SY0909两个毒株之间的核苷酸同源性为98.3%,与其它PRRSV分离株进行遗传进化分析,BB0907与SY0909处于第Ⅳ亚群。(3)SY0909与BB0907毒株序列比较,结果显示,变异部位主要集中于Nsp2和GP5,Nsp2同源性为97.7%,与传统毒株相比均缺失30个氨基酸,SY0909株GP5蛋白中和表位上游缺失一个糖基化位点(NGS)。由此推测,SY0909毒株毒力明显低于BB0907毒株的原因可能为GP5蛋白NGS的变化和基因组内分散存在的氨基酸突变。2.我国猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801分离株分子特征猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起国内外养猪业严重经济损失的重要病原之一,病毒基因和毒力变异较大。PRRSV NT0801株分离自我国发病猪群,毒力较强,但NSP2基因不存在高致病性PRRSV30个氨基酸的缺失。为了进一步阐明该分离株的分子特征,本研究对该毒株全基因序列进行了测定和分析,结果为：(1)该毒株基因组全长15439bp,其中包含29nt Poly (A).与高致病性PRRSV毒株JXA1比较,核酸序列同源性为96.7%,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为97.2%和98.5%,但NSP2基因无30个氨基酸的缺失；与传统型毒株ch-la比较,推导的GP3和GP5氨基酸序列同源性分别为92.9%和91.5%；(2)基因进化树分析结果显示,该毒株介于高致病性和传统PRRSV毒株之间。与其它不同毒力PRRSV分离株基因序列比较,未发现明显重组信号。(3)不同毒力毒株氨基酸残基比对分析结果显示,15个位点潜在毒力相关氨基酸残基中,该毒株有9个与高致病性PRRSV毒株一致,3个与高致病性PRRSV毒株不同,但与传统型和JXA1疫苗析相同,1个位点只与JXA1疫苗株相同,2个与其他毒株都不相同。表明该分离株与高致病性PRRSV密切相关,PRRSV流行毒株变异与基因突变有关,从而为该病毒毒力基因定位研究奠定了基础。3.猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801传代与不同代次病毒对仔猪致病性研究本研究将PRRSV NT0801株在Marc-145细胞连续传代至70代,观察CPE和病毒滴度稳定性,取NT0801F6代和F70代次病毒液分别感染28日龄PRRSV和PCV2阴性健康商品仔猪各6头,攻毒剂量均为105.5TCID50/头,同时取6头同批仔猪注射PRRSV BB0907作为强毒对照,并取6头同批仔猪作为空白对照。隔离饲养15d,每天观察临床症状。攻毒后不同时间测定病毒血症,并对死亡猪和第15天处死猪进行病理剖解、观察肉眼病理变化和组织病理变化,结果显示：(1)病毒传代至20代,接种细胞后3d,70%以上细胞出现CPE,病毒TCID50稳定为10-70-10-7.25/ml。(2)NT0801F6和NT0801F70感染组仔猪体温无明显变化,NT0801F6感染组仔猪出现轻微,临床症状、有明显的间质性肺炎病变,NT0801F70代感染组仔猪无明显异常,肺脏无明显肉眼和组织病理学变化；而BB0907感染组仔猪体温明显升高,,临床症状明显,可引起2/6死亡,病猪肺脏组织病理学变化严重,肺泡间质增宽；对照组猪无临床异常表现和病理变化。(3)NT0801F6和NT0801F70感染组病毒血症持续时间长于BB0907F6组,血清中病毒含量NT0801F6> NT0801F70> BB0907F6。(4) NT0801F6和NT0801F70感染组血清ELISA抗体水平低于BB0907F6组。(5) NT0801F70和F6代次病毒基因序列分析结果显示,Nsp2、GP3、GP5和N蛋白分别有4、3、3和0个氨基酸位点发生变异。该研究结果表明,NT0801传代至F70代对仔猪致病性明显减弱,为PRRSV活疫苗研究奠定了重要基础。4.猪繁殖与呼吸综合征病毒NT0801-F70弱毒株免疫保护效力研究本研究选用NT0801-F70弱毒株接种28日龄PRRSV和PCV2阴性的健康仔猪,免疫后3周用BB0907强毒攻毒。隔离饲养21d,每天观察临床症状,采取不同时间血清,分别测定病毒血症和PRRSV ELISA抗体,攻毒后两周剖解仔猪观察肉眼病理变化和组织病理变化,结果为：(1) NT0801-F70弱毒株免疫后仔猪体温无明显变化,未出现明显临床症状；强毒株攻毒后,免疫组仔猪在第4天体温升高至40.3℃,仅持续2-3天,而未免疫组第1天体温就升高至41℃,持续11天。(2) NT0801-F70弱毒株免疫后12天仔猪能产生低水平的抗体,强毒株攻毒后免疫组抗体水平迅速提高,明显高于未免疫组。(3)强毒株攻毒后,免疫组未检测到病毒血症,而未免疫组在攻毒后第7天血清中病毒含量较高。(4)强毒株攻毒后,免疫组仔猪肺脏组织病理学变化较轻,而未免疫组仔猪肺脏组织病理学变化严重。该研究结果表明,NT0801-F70弱毒株免疫仔猪安全,并可以提供较好的免疫保护作用,可作为PRRSV活疫苗新毒株。