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人类基因组计划的顺利完成，加速了功能基因的阐明和疾病相关基因的发现，也加深了人类从医学和生理学角度对自身的认识，使方兴未艾的基因治疗，成为21世纪生物医药领域的研究热点。
随着肿瘤发生发展的分子机制研究不断深入，人们逐渐认识到肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤和多基因参与的复杂过程，细胞周期调控异常和细胞凋亡障碍则是其中最关键的两个分子事件。国内外大量研究表明，p27低表达与肺癌的发生以及预后差有密切关系，p27基因可以作为治疗基因，用于肺癌的基因治疗。用基因传递载体携带p27基因治疗小鼠肺部肿瘤，国内外尚未见报道。
虽然近20年来基因治疗取得了很大的发展，但当前基因治疗研究中还存在很多技术性的难题，其中之一就是治疗基因的有效传输。目前的基因传递系统主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然具有比较高的转染效率，但是它们的生物安全性问题至今尚未得到很好的解决。非病毒载体安全性高，易于大规模生产，其中阳离子脂质体的发展最为成熟。但是阳离子脂质体／DNA复合物(LPPs)不能将目的基因包裹在脂质体内部，稳定性较差，体内实验的效果欠佳，因此基因治疗对于新型非病毒基因传递系统的需要仍然十分迫切。
针对当前肺癌缺乏有效治疗手段的现状，本研究就利用细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27基因治疗小鼠肺癌，并联合化疗药物进行联合治疗进行了探讨。本课题系统地研究了载基因纳米脂质体(DNLs)的制备处方工艺条件，考察了其体内外转染能力及细胞毒性，并建立了小鼠肺转移肿瘤模型，用DNLs携带治疗基因，进行了体内外药效学研究，在此基础上，我们还对其体内外抗肿瘤效果进行了初步的机理研究。
我们首先利用转化的大肠杆菌DH5-α分别扩增了实验需要的报告基因和治疗基因，按照试剂盒说明裂解细菌后，利用阴离子交换树脂分离纯化了质粒DNA，采用紫外分光光度法测定了其含量，通过计算A<,260>／A<,280>的比值，证明其纯度符合要求；我们又采用琼脂糖凝胶电泳进一步考察了质粒DNA的纯度和构型，结果表明纯化产物的纯度和构型均符合要求。 随后，我们采用荧光分光光度法，利用荧光染料Hoechst 33258与DNA结合发出荧光的原理，建立了DNA的含量测定方法。我们通过测定溶液的浊度变化，精确考察了阳离子脂质DDAB与DNA的最佳比例，并通过试验比较，选择了离子型表面活性剂溶液作为工作介质，成功地用DDAB缩合了质粒DNA，为下一步的包封做了必要的准备。我们采用去污剂分散法，以粒径和多分散指数(PDI)以及包封率为指标，通过单因素试验筛选了处方工艺条件，以融合性脂质DOPE与DDAB／DNA缩合物一起制备了DNLs。用筛选后的处方工艺条件制得的DNLs为较为规则的圆球，粒径为86.34±6.26nm，PDI为0.11±0.02，zeta电位为-23.77±2.97mV，包封率为86.02±3.08％，可以保护目的基因不受核酸酶降解。
我们运用体外细胞培养技术，分别利用两种报告基因，考察了DNLs的体外细胞转染能力。以pORF-LacZ为目的基因，转染了HepG 2和SMMC-7721细胞，β-Gal分析结果表明，LacZ-DNLs的转染能力显著高于裸DNA，而与商品化阳离子脂质体Lipofectamine 2000不存在显著性差异；进一步试验表明，LacZ-DNL对：HepG 2和SMMC-772l两种细胞的转染效果均具有一定的剂量依赖性。以pEYFP-C1-p27为目的基因，转染了LLC和HepG 2细胞，流式细胞检测结果表明，p27-DNLs和Lipofectamine 2000的细胞转染率没有显著性差别，而显著高于裸DNA，从而进一步证明了DNLs是一种高效的基因转移载体。MTT分析表明，高、中、低三个剂量组的空白脂质体对工J929细胞均未显示出明显的细胞毒性。为预测p27-DNLs的体内药效学，我们用其转染了A549细胞，初步评价了它对肿瘤细胞的生长抑制效果。试验结果表明，在96孔板中，p27-DNLs能够明显抑制A549细胞的生长。我们借助流式细胞分析技术进一步探讨了p27-DNLs抑制肿瘤细胞增殖的机理，结果显示，p27-DNLs能够显著提高停滞在G<,1>期的肿瘤细胞数量，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。
我们以外观、色泽以及再分散性为指标，筛选了DNLs的冻干粉针剂处方，制备出的DNIs冻干粉针剂达到了设计要求。初步稳定性试验结果表明，DNLs冻干粉针剂在-20℃冰箱中储存放置3个月之后，其粒径、zeta电位、包封率、对核酸的保护能力以及细胞转染能力与冻干前相比均无明显变化。
我们以EYFP为报告基因，将pEYFP-C1-p27-DNLs冻干粉针剂经尾静脉注射到小鼠体内，48 h后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺和肾脏，做石蜡切片，利用荧光显微镜观察EYFP在各脏器的表达，考察了DNLs携带目的基因在小鼠体内的表达分布。结果表明，EYFP在小鼠的肺和肝脏有相对较多的表达，在脾脏有少量表达，在心和肾脏未见明显表达。
我们建立了小鼠肺转移肿瘤模型，通过尾静脉给药，评价了DNLs冻干粉针剂和LPDs冻干粉针剂携带治疗基因p27在体内的抗肿瘤效果，并通过与化疗药物顺铂(DPP)联用，进一步评价了基因药物与化疗药物的联合治疗效果。试验结果表明，荷瘤小鼠经p27-DNLs冻干粉针剂及p27一L,PDs冻干粉针剂治疗后，生存期显著长于PBS组、空白脂质体组、裸DNA组以及MCS-DNLs组；p27-DNLs及p27-LPDs两种冻干粉针剂分别与DPP联合治疗组小鼠的生存期均显著长于p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂单独治疗组，说明联合治疗取得了成功。病理学及肿瘤组织的检测结果表明，p27-DNLs冻干粉针剂组及p27-LPDs冻干粉针剂组和联合治疗组小鼠的肺脏湿重以及转移灶数量均显著少于PBS组、空白脂质体组、裸DNA组以及MCS-DNLs组。以上试验结果说明联合治疗能够进一步提高疗效。我们通过免疫组织化学方法对1927．DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂的体内抑癌机理进行了初步研究，结果表明，荷瘤小鼠给予p27-DNLs冻干粉针剂或p27-LPDs冻干粉针剂之后，肿瘤组织中均明显表达出目的蛋白p27<,kipI>，说明它们的抗肿瘤作用可能是通过表达p27<,kipI>实现的。
综上所述，我们采用了阳离子脂质成功缩合了质粒DNA，为将DNA包裹在脂质体内部打下了良好的基础，可望作为一种平台技术，用于制备非病毒基因传递系统。本课题制备的新型纳米脂质体基因传递系统能有效介导目的基因的体内外转染，为治疗基因在体内外的转移提供了一种新型、有效的载体系统。p27-DNLs冻干粉针剂及p27-LPDs冻干粉针剂均能有效抑制肺部肿瘤的生长，有望将它们开发成用于治疗肺癌的基因药物。本研究提出的细胞周期调控基因治疗联合化疗方法，可望为肿瘤的治疗提供新的思路。