前言:重度抑郁(major depressive disorder，MDD)是全球发病率最高的精神障碍类疾病，全世界有近10％的人饱受抑郁症病痛的折磨。MDD患者临床表现主要有情绪低落、快感丧失、自卑感和对原有喜欢的事物丧失兴趣并伴随某些躯体症状。MDD患者脑内病变涉及前额皮质（prefrontal cortex，PFC）、前扣带回皮质、丘脑、海马、杏仁核以及基底神经节等多个区域，并与机体能量代谢失衡、炎症、神经可塑性改变以及转导通路调节异常相关。　　近年来的研究表明，中枢神经系统(central neuron system，CNS)的重要组成成份星形胶质细胞与MDD具有密切的生物学相关性。MDD所引发的星形胶质细胞的病理改变不是反应性的细胞胶质化或胶质细胞的病理性肥大，而是细胞的胶质性退化。选择性地破坏脑内星形胶质细胞，即可以导致实验动物产生抑郁样行为。脑内糖代谢率降低是MDD患者脑内能量代谢异常表现之一，并且该代谢率降低的幅度与病情严重程度相关。经帕罗西汀等五羟色胺再摄取抑制剂(serotonin specificreuptake inhibitors，SSRIs)治疗后，MDD患者脑内病变区域的糖代谢可以得到回升。本课题组前期研究成果表明，发生于原代培养的星形胶质细胞内的糖酵解对于神经细胞内K+的缓冲、神经递质传递以及学习和记忆等生物学进程至关重要。　　生物体内的糖原代谢主要受磷酸化和变构作用的调节。糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase3，GSK-3)是参与糖原磷酸化调节的关键酶之一，最早发现于家兔骨骼肌分次提取物，存在旺和β两种亚型。作为AKT下游的重要蛋白底物，GSK-3蛋白的活性改变常见于糖尿病和阿尔兹海默症(Alzheimers disease，AD)，并与情感障碍类疾病密切相关。同源性磷酸酶张力蛋白(phosphatase and tensinhomolog，PTEN)是人类发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌因子，它可以通过去磷酸化作用促进PIP3转化为PIP2，抑制GSK-3β上游通路PI3K/AKT的活性。有关肺纤维化的研究发现，小窝蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）可以通过特定的蛋白结构区域与PTEN蛋白结合并发生生物学相互作用，从而促进PTEN的膜锚定，最终影响其下游分子信号通路PI3K/AKT的转导。　　氟西汀是临床上第一例人工合成的SSIRs类抗抑郁药。该药虽然能在短时间内提升突触间隙五羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的浓度，但需要2-4周才能显效。由此可见，氟西汀的药理学作用机制尚不明了，还有待进一步的研究。本课题组前期研究发现，氟西汀的药理学活性之一是作为激动剂直接作用于原代培养的星形胶质细胞表面的5-HT2B受体。急性给药处理后，可引发上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）间接激活，进而影响星形胶质细胞内MAPK/ERK和PI3K/AKT两大信号通路的转导。在随后的肝性脑病研究中，本课题组还发现铵盐可以经由Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信号通路降低星形胶质细胞内GSK-3β的蛋白磷酸化水平，并影响脑内的糖原代谢。由此可以推想:氟西汀长期作用很可能是通过调节原代培养的星形胶质细胞内Cav-1的表达，影响星形胶质细胞内糖原的含量。针对这一假想，本论文通过一系列实验检测了:(i)氟西汀长期作用对星形胶质细胞内Cav-1蛋白表达的影响;(ii)氟西汀长期给药对星形胶质细胞膜上PTEN蛋白含量以及AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的影响;(iii)氟西汀长期作用对离体星形胶质细胞内糖原含量的影响。　　方法:1、应用细胞原代培养技术分离并提取新生CD-1小鼠大脑皮层神经胶质细胞，经2周培养获得分化成熟的星形胶质细胞。2、应用RNAi技术下调星形胶质细胞内Cav-1的表达。3、应用lysisbuffer和Trizol裂解液裂解并提取细胞胞浆内的蛋白和细胞内mRNA。4、应用特制的膜制备液裂解并提取细胞膜蛋白。5、应用Lowery法测定经lysis buffer细胞裂解液收集和提取的蛋白样品的浓度。6、应用western blotting技术检测经不同实验处理因素作用之后，星形胶质细胞内目的蛋白的含量和活性。7、应用RT-PCR技术检测经不同浓度氟西汀(0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM)给药2周后，星形胶质细胞内PTEN mRNA的表达水平。8、应用TECAN M200多功能酶标仪检测经不同浓度氟西汀（1μM和10μM）处理14天后，星形胶质细胞内NADPH荧光强度值，由此间接测得星形胶质细胞内糖原的含量。9、采用one-way ANOVA方法对结果进行分析统计，P＜0.05表示具有统计学意义。　　结果:1、实验方法的鉴定。1）星形胶质细胞的原代培养;2）Lowery法可用于本实验中蛋白样品的定量;3）RNAi技术下调Cav-1的表达。2、不同浓度氟西汀的急性作用。不同浓度氟西汀（0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM）急性处理细胞（10分钟、20分钟、40分钟和2小时）后，可得到AKT蛋白磷酸化水平的浓度时间柱状图。经药物急性作用10分钟后，只有高浓度组（5μM和10μM）样品的AKT蛋白磷酸化水平增高;20分钟后，AKT的蛋白磷酸化水平呈现浓度依赖性地增高;40分钟后，AKT磷酸化水平降低至正常水平，仅10μM组还留有微小的上升作用;2小时后，所有浓度组AKT蛋白磷酸化水平和对照组相比均无统计学差异。3、不同浓度氟西汀的长期作用。1）不同浓度氟西汀长期给药可以双向调节星形胶质细胞内Cav-1蛋白水平和膜PTEN蛋白含量，但不影响细胞内PTEN蛋白的含量。其中，星形胶质细胞内Cav-1蛋白和质膜上的PTEN蛋白含量呈现浓度依赖性改变，低浓度组（0.1μM、0.5μM和1μM）Cav-1蛋白表达水平和膜PTEN蛋白含量显著减少，而高浓度组（5μM和10μM）Cav-1蛋白表达水平和膜PTEN蛋白含量显著增加。1μM浓度组的Cav-1蛋白表达水平和膜PTEN蛋白含量下降最为明显，10μM浓度组Cav-1蛋白表达水平和膜PTEN蛋白含量的升高幅度最大。2）不同浓度氟西汀慢性处理双向调节星形胶质细胞内AKT和GSK-3β的蛋白磷酸化水平。其中，低浓度组（0.1μM、0.5μM和1μM）AKT和GSK-3β蛋白表达显著增强，而高浓度组（5μM和10μM）的AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平则显著下调，且高低浓度组间无统计学差异。3）PTEN抑制剂Bpv(HOpic)的作用。Bpv(HOpic)能够抑制低浓度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀对AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，同时也能消除高浓度（5μM和10μM）氟西汀对AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的下调作用。4）RNAi的结果。Cav-1 siRNA转染不能消除低浓度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀对AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，但能消除高浓度（5μM和10μM）氟西汀对AKT蛋白磷酸化水平的下调作用。4、不同浓度氟西汀慢性处理双向调节星形胶质细胞内糖原的含量。经1μM氟西汀作用2周后，星形胶质细胞内糖原的含量增加，而10μM氟西汀作用2周后的结果与此相反。5、图解氟西汀双向调节星形胶质细胞内糖原含量的机制。　　讨论:高GSK-3β蛋白活性是重度抑郁和双相情感障碍的致病因素之一，GSK-3β基因表达的上调以及蛋白磷酸化水平的降低均可导致GSK-3β活性增强。过表达GSK-3β的小鼠可呈现抑郁前临床表现，且对长期和缓刺激(chronic moderatestimulus，CMS)的敏感性增加。氟西汀急性给药虽然不能缓解CMS所致的临床表征，但经氟西汀长期治疗后可以缓解这些行为学的异常。然而也有研究认为，抗抑郁治疗会引发GSK-3β活性增高，例如长期服用舍曲林可增强老年抑郁症患者血小板内的GSK-3β活性。本论文的研究结果为该争议提供了一个合理解释，即该现象可能是基于SSRIs对细胞内Cav-1基因表达的非线性调节。　　与此同时，本论文的研究还发现，经氟西汀急性给药之后，星形胶质细胞内AKT蛋白磷酸化水平呈现给药浓度依赖性地升高，但该急性激活效应维持时间很短暂。药物作用2小时后，星形胶质细胞内AKT蛋白磷酸化水平即与对照组无统计学差异，并且随着给药时间的延长，氟西汀长期作用逐渐显现。此外，本论文通过应用RNAi技术以及抑制剂Bpv(HOpic)，特异性地下调Cav-1表达或抑制PTEN蛋白的活性，进一步证实了氟西汀可以经由Cav-1/PTEN/AKT/GSK-3β通路对星形胶质细胞内糖原含量进行双向调控。　　结论:本论文首次对氟西汀长期给药对GSK-3β活性的双向调控作用进行了探究:氟西汀长期给药可通过双向调控Cav-1/PTEN/PI3 K/AKT通路的活性，双向调节星形胶质细胞内GSK-3β的蛋白活性，并最终影响细胞内糖原的含量。氟西汀的该双向调控作用与其疗效和副作用息息相关。