【摘 要】
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苦荞（Fagopyrum tataricum（L）Gaertn.）,作为一种富含芦丁、花青素和原花青素等黄酮化合物的药食两用杂粮作物,其保健作用日益受到重视。尽管芦丁含量是苦荞重要的品质性状,但花青素和原花青素不仅与苦荞抗逆应答有关,还可以赋予苦荞额外的观赏和食用价值。植物花青素和原花青素的生物合成,主要受到R2R3-MYB型的SG4亚家族成员转录因子的调控。本研究针对一个归属于R2R3-MYB
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苦荞（Fagopyrum tataricum（L）Gaertn.）,作为一种富含芦丁、花青素和原花青素等黄酮化合物的药食两用杂粮作物,其保健作用日益受到重视。尽管芦丁含量是苦荞重要的品质性状,但花青素和原花青素不仅与苦荞抗逆应答有关,还可以赋予苦荞额外的观赏和食用价值。植物花青素和原花青素的生物合成,主要受到R2R3-MYB型的SG4亚家族成员转录因子的调控。本研究针对一个归属于R2R3-MYB SG4-Like亚家族的苦荞转录因子FtMYB18,通过分子特征分析、基因表达模式、生物学效应和分子互作等方面的研究,着重探究了截短C5基序（TLLLF）的突变体FtMYB18-ΔC对功能的影响,以期揭示FtMYB18参与花青素和原花青素生物合成的分子调控机制。主要研究结果如下:1.FtMYB18序列分析表明,FtMYB18基因的g DNA序列含有3个外显子和2个内含子,ORF大小为732bp,编码243个氨基酸。多重序列对比表明,FtMYB18蛋白N端含有一个b HLH motif,C端含有SG4-Like保守基序C1 motif、C2/EAR motif和C5（TLLLF）motif。系统进化分析表明,FtMYB18归属可能参与花青素与原花青素合成调控的R2R3-MYB SG4-Like亚家族。转录激活实验表明,FtMYB18/FtMYB18-ΔC都具有单独的转录激活活性。瞬时转染洋葱表皮细胞实验表明,FtMYB18/FtMYB18-ΔC均定位于细胞核。2.克隆获得FtMYB18基因5’上游2457 bp的启动子序列,并构建p BI101-PFtMYB18-GUS植物表达载体,采用根癌农杆菌GV3101介导瞬时转染苦荞叶片。Gus染色分析表明,报告基因转录活性受到UV-B和ABA的显著诱导（P＜0.05）,受到Me JA的显著抑制（P＜0.05）,而对冷处理应答不显著（P＞0.05）。进一步采用外源理化因子处理苦荞后,q PCR分析表明FtMYB18基因的表达对Me JA和ABA处理响应强烈（P＜0.05）。3.构建重组表达载体p CHF3-FtMYB18-YFP和p CHF3-FtMYB18-ΔC-YFP,经根癌农杆菌GV3101介导转染烟草和拟南芥,经发根农杆菌A4介导转染苦荞毛状根,筛选获得阳性株系。与野生型相比,过表达FtMYB18烟草花、拟南芥幼苗/种子和苦荞毛状根颜色变浅,其花青素含量和原花青素含量均显著降低（P＜0.05）,芦丁含量无显著变化（P＞0.05）,且而黄酮代谢途径中CHS和DFR等基因的表达量显著下调（P＜0.05）;而过表达FtMYB18-ΔC植物中花青素、原花青素和芦丁含量无显著性差异（P＞0.05）,黄酮代谢途径中CHS基因表达量恢复至野生型水平（P＞0.05）。荧光素酶报告实验证明,FtMYB18能显著抑制FtCHS和FtDFR启动子的转录活性,而C5基序缺失后则消除了此抑制作用。4.酵母双杂交实验表明,MBW三元复合物中由FtTT8编码的b HLH和由FtTTG1编码的WD40均能与FtMYB18/FtMYB18-ΔC产生互作。酵母三杂交实验证明,FtMYB18/FtMYB18-ΔC能与FtTT8-FtTTG1互作形成MBW三元复合物。烟草瞬时转染实验证明,FtMYB18-FtTT8-FtTTG1复合物抑制花青素的合成。C5基序的缺失会削弱上述三元复合物的活性及其对花青素合成的抑制效应。5.FtMYB18能与茉莉酸信号通路相关蛋白FtJAZ1、FtJAZ3、FtJAZ4和FtJAZ7产生互作,并减少花青素的积累。C5基序缺失后,FtMYB18-ΔC不能与FtJAZ3和FtJAZ4互作,并消除对花青素合成的抑制效应,但不影响与FtJAZ1和FtJAZ7的互作和抑制效应。综上表明,FtMYB18作为一个功能独特的SG4-Like-MYB转录因子,可介导MBW复合物形成和JAZ蛋白互作,并通过对CHS和DFR基因的特异性下调表达,抑制植物花青素和原花青素的合成,而C5基序具有削弱或消除上述作用的功能。
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