研究背景心力衰竭是一种复杂的临床综合征,由于心脏结构或功能的异常,损害了心脏的充盈或射血能力,导致心输出量不能满足机体组织代谢需要。常见的临床症状包括呼吸困难、体力活动受限、体液潴留等。心力衰竭的病理生理机制复杂,心肌细胞凋亡在心力衰竭的形成及进展过程中起着重要的作用,抑制心肌细胞凋亡对于心力衰竭的防治具有积极的意义。磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)信号传导通路参与哺乳动物心肌细胞凋亡的调控,其中AKT蛋白的活性在心力衰竭过程中变化复杂。有研究显示,长期AKT蛋白活化可以引起心肌细胞的病理性肥大与心腔扩大,导致心脏收缩功能障碍,加速心力衰竭恶化。晚期心力衰竭病人AKT蛋白磷酸化升高,经过左室辅助装置治疗后,AKT蛋白磷酸化显著下降,心功能明显改善。但是也有报道显示AKT的短期活化可以抑制细胞凋亡因子、促进心肌细胞能量代谢及抑制炎症反应,逆向改善心功能,对心力衰竭的患者有益。雷帕霉素属于大环内酯类抗生素,近年来的研究发现其具有心脏保护作用。雷帕霉素可以逆转压力负荷增加引起的心肌肥厚和心脏扩大,改善心脏功能。也有研究表明,雷帕霉素作为mTOR抑制剂,不同剂量条件下对AKT蛋白活性影响不同。在低浓度条件下通过抑制mTORCl,可以增加AKT蛋白的活性,而在高浓度条件下,雷帕霉素则可以抑制AKT蛋白的活性,机制可能主要是通过mTORC2通路。然而,据我们调研,国内外目前尚没有大规模的研究关注雷帕霉素对心力衰竭大鼠心肌细胞细胞凋亡的影响以及PI3K-AKT-mTOR通路的AKT蛋白在此进展过程中的作用。研究目的本实验研究旨在评价不同剂量的雷帕霉素对心力衰竭大鼠心脏的干预效果,以超声心动图、BNP、心肌组织病理改变、心肌细胞凋亡指数及心肌组织AKT蛋白磷酸化等指标,探讨雷帕霉素对心力衰竭大鼠心肌细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路中AKT蛋白活性变化及心肌细胞凋亡和心脏功能的影响,期待能够为雷帕霉素对心肌细胞的保护作用和心力衰竭药物治疗的进展提供一些新的理论依据。研究方法65只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,适应性喂养1周,随机选取10只作为假手术组(n=10,空白组)。其余采用腹主动脉缩窄术的方法建立大鼠心力衰竭模型,8周后将造模成功的40只大鼠随机分为模型组(n=10)、低剂量雷帕霉素+模型组(n=10,1mg/kg/d;低剂量组)、中剂量雷帕霉素+模型组(n=10,2.5 mg/kg/d;中剂量组)、高剂量雷帕霉素+模型组(n=10,4.5 mg/kg/d;高剂量组)。雷帕霉素通过尾静脉注射,连续给药四周。治疗结束后,观察大鼠的一般情况,应用超声心动图评价大鼠的心脏功能,用ELISA试剂盒检测大鼠血清中B型脑钠肽水平,HE染色观察大鼠心肌组织的病理变化,TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况,Western Blot检测大鼠心肌组织中PI3K-AKT-mTOR信号通路的关键蛋白AKT磷酸化的表达情况。明确不同剂量的雷帕霉素对心力衰竭大鼠心肌细胞中AKT蛋白磷酸化表达及心肌细胞凋亡和心脏功能的影响。研究结果1.大鼠一般状态:空白组大鼠生长良好,一般状态与生存质量可;模型组大鼠逐渐出现心功能不全的症状与体征,一般状态与生存质量差。与模型组相比,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素给药剂量的逐渐增加,一般状态改善以及生存质量提高的程度均逐渐增加,以高剂量组大鼠改善与提高的程度最明显。2.超声心动图检查结果:与空白组比较,模型组室壁运动减弱,左室舒张末径(LVIDd,mm)和左室收缩末径(LVIDs,mm)明显增加(p<0.01),左室射血分数(LVEF,%)和左室短轴缩短率(LVFS,%)明显减低(p<0.01)。与模型组比较,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素给药剂量的增加,室壁运动逐渐增强,LVIDd、LVIDs数值逐渐降低,LVEF、LVFS数值逐渐增加(p<0.05,p<0.01)。与低剂量组相比,中、大剂量雷帕霉素给药组的LVIDd、LVIDs值均减低,LVEF、LVFS均增加(p<0.05,p<0.01)。3.大鼠组织形态学变化:肉眼观察心脏大体形态发现,空白组大鼠心脏几何形态完整,心腔大小正常,呈鲜红色,弹性及韧性良好。模型组大鼠心脏失去原有的几何形态,心腔明显扩大,呈暗红色,弹性及韧性差。雷帕霉素+模型各组心腔均有不同程度扩大,但与模型组相比,随着雷帕霉素给药剂量的增加,心腔扩大程度逐渐减低,颜色呈暗红色,弹性及韧性尚可。用HE染色观察心肌组织病理改变,包括心肌细胞大小及水肿情况、心肌纤维结构排列情况、细胞间质改变等。空白组大鼠:心肌细胞排列整齐、心肌纤维呈平行排列且紧密,呈束状,横纹清晰可见,胞核清晰,心肌细胞形态大小正常。模型组大鼠:心肌细胞水肿、肥大,有大量空泡,其大小和形状不同,心肌细胞形态各异。心肌纤维断裂、排列紊乱,呈波浪形改变,部分心肌纤维消失,炎性细胞浸润。与模型组比较,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素给药剂量的增加,心肌细胞肿胀、心肌纤维结构排列情况、炎性细胞浸润等均呈现不能程度的改善,且改善程度逐渐增加。高剂量组大鼠心肌细胞形态、心肌纤维排列程度等均接近空白组,改善程度最佳。4.大鼠血清BNP的水平:ELISA试剂盒检测显示:与空白相比较,模型组的BNP水平显著升高,具有显著的统计学差异(p<0.01)。然而,与模型组相比,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素给药剂量逐渐增加,BNP水平逐渐降低,具有统计学差异(p<0.05,p<0.01)。与低剂量组相比,高剂量组BNP水平明显减低(p<0.05)。5.大鼠心肌细胞的凋亡情况:TUNEL检测显示,与空白相比较,模型组心肌细胞凋亡指数显著增加,具有显著的统计学意义(p<0.01)。与模型组相比,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素剂量的增加,心肌细胞的凋亡指数均有不同程度的降低,中剂量组、高剂量组凋亡指数均明显减低(p<0.05,p<0.01),低剂量组凋亡指数减低无统计学意义(p>0.05)。雷帕霉素高剂量组心肌细胞凋亡指数明显低于低剂量组(p<0.05)。6.大鼠心肌细胞AKT蛋白磷酸化情况:Western Blot检测显示,与空白组比较,模型组p-AKT蛋白表达明显增加,具有显著的统计学差异(p<0.01)。与模型组比较,雷帕霉素+模型各组,随着雷帕霉素剂量增加,p-AKT蛋白表达逐渐降低。雷帕霉素低、中、高剂量组p-AKT蛋白表达均明显低于模型组(p<0.05,p<0.01)。与低剂量组相比,中、高剂量组p-AKT蛋白表达明显降低(p<0.05)。研究结论1.雷帕霉素可以呈剂量依赖性改善心力衰竭大鼠的一般状态,提高心力衰竭大鼠的生存质量。2.雷帕霉素能够呈剂量依赖性的改善心力衰竭大鼠超声心动图的各项指标,降低LVIDd、LVIDs,升高LVEF、LVFS,逆转心腔扩大,增强大鼠的心脏射血功能,对心力衰竭大鼠的心衰进展有明显的预防作用,可以延缓心力衰竭的进展。3.雷帕霉素可以呈剂量依赖性逆转心力衰竭大鼠心脏扩大等肉眼改变及心肌细胞水肿、心肌纤维排列紊乱及炎性细胞浸润等病理改变,延缓心肌组织重塑,改善心力衰竭大鼠心脏功能。4.雷帕霉素呈剂量依赖性降低心力衰竭大鼠血清中心力衰竭标志物BNP的水平,改善大鼠的心脏功能。5.压力负荷增加诱导的心力衰竭大鼠心肌细胞发生了细胞凋亡,细胞凋亡在心力衰竭发生发展过程中起到重要作用。而雷帕霉素可以呈剂量依赖性降低心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡指数,减轻心肌细胞凋亡,从而改善心力衰竭大鼠心脏功能。6.雷帕霉素可以呈剂量依赖性降低心力衰竭大鼠心肌组织中PI3K-AKT-mTOR信号通路的关键蛋白AKT的过度磷酸化表达。7.综合以上各方面的实验结果,我们得出初步结论,雷帕霉素可能通过对于AKT蛋白过度磷酸化的抑制来影响PI3K-AKT-mTOR信号通路,减轻心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡水平,从而提高左室射血分数,降低血清BNP水平、逆转心脏扩大和心肌组织病理改变,延缓心力衰竭进展,达到改善心力衰竭大鼠心脏功能的效果,我们的结果为雷帕霉素在心力衰竭临床应用提供一定的动物实验理论依据。