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背景 增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是视网膜脱离手术最常见的失败原因。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）等移行至玻璃体或视网膜表面，增生并形成收缩膜，导致牵拉性视网膜脱离，最终引起视力丧失。 由于一些病例在手术治疗后仍难以治愈，许多研究者致力于药物辅助治疗来控制PVR的发生，如用糖皮质激素和抗代谢药等，然而这些药物均存在药效较弱、毒性较大等问题，并且缺乏对照的前瞻研究。因此需要寻找一些更安全、更有效的药物来防治PVR。金丝桃素（hypericin）是具有这种治疗潜能的药物之一。 金丝桃素是从金丝桃家族中提取的多环二酮类紫色结晶颜料。它是光动力药，用可见光照射后能产生单态氧和自由基。在国外作为抗抑郁药临床应用，患者有很好的耐受性并且无明显的副作用。金丝桃素又是抗病毒药，能抑制人免疫缺陷病毒、流感病毒和仙台病毒。金丝桃素还是蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）的特异性抑制剂，在许多类细胞中，PKC是转导细胞外信号到细胞内反应的细胞内酶家族，能抑制细胞增殖并能特异性地诱导细胞凋亡。已证实金丝桃素对不同细胞的抗增殖效果及抗病毒能力是抑制PKC的结果；在PVR发生中，RPE上PKC对RPE的增殖、移行、吞噬和胶原纤维收缩发挥着重要的作用。因此，金丝桃素可能抑制RPE行为失控，从而防止PVR的发生。目的 研究金丝桃素对体外培养的人RPE增殖和凋亡、PKC活性和Ca2+信号的影响，并用金丝桃素进行初步的动物实验，探讨药物防止PVR的某些基本机理。方法 （1）用含0.5μM—5μM金丝桃素不同浓度的血清培养人RPE，用细胞计数法、MTT比色法和流式细胞仪（flow cytometry，FCM）测定细胞的增殖，FCM测定细胞凋亡。（2）用含0.5μM—5μM金丝桃素的10％血清培养人RPE，在有或没有PKC激活剂佛波醇—12—豆蔻酰—13乙酸（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）预处理RPE的情况下，用PKC检测试剂盒测定金丝桃素对胞液PKC（cytosolic PKC， 第四军医大学博士学位论文 一 c－PKC）和胞膜叫C（membranous PKC，m－PKC）活性的变化。（3）使 用新一代钙荧光指示剂 fluo七 AM和激光扫描共聚焦显微镜门aser scanning confocal microscope，LSCM)，分析在 100n M 佛波酯（PMA） 和（或）5个浓度的金丝桃素（IVM、ZVM、3VM、4VM和SVM）刺 激时培养的人 RPE的 Ca‘’信号的变化。N)用自体富含血小板血浆玻璃 体注射制备兔外伤性 PVR模型，并同时将生理盐水、IV M、10 V M和 100 u M金丝桃素 0．lml注入兔眼玻璃体内，在不同时间点观察金丝桃 素对PVR形成的防治作用。 结果（1）①药物作用3d后细胞计数法显示金丝桃素抑制RPE增殖，呈 明显的剂量依赖性。第 3天在含 1％血清的培养液中，金丝桃素对 RPE 的半数抑帘浓度（inhibition concentration50，IC。。）为 1．4 u M。② MTT比色法的剂量效应关系实验结果为：在对照组中，A值均为 0．189。 在金丝桃素（浓度分别为0．svM、lpM、2．svM和spM）每个血清浓 度（10％、5％和 1％）组中，A值分别为 0．163士 0．002，0．160士 0．003，0．170土 0．002；0 180士 0．003，0．147士 0 003，0．076士 0．002： O．164士o．002，0．132士O．002，0．034士0．002：0．129士0．002，0．028土一、0．002，0．009士0002。抑制率分别为 13．76％，15．34％，10．05％；4．76％， 22．22％，59．79％：13．23％，30．16％，82．01％：31．75％，85．19％，95．24％。金丝 桃素对 RPE有剂量依赖性抑制，2种血清浓度（5％和 1％）金丝桃素 的IC。值分别为3．4卜M和0．8卜M。时间效应关系实验结果为：金丝桃 素能抑制PMA导致的RPE增殖，随着时间延长，金丝桃素的抑制作用 逐渐增强。＠FCM显示在正常组和金丝桃素组（浓度分别为 0．SVM、l pM、2．SVM和SVM）的S期百分比分别为18．l％、16．8％、16．4％、13．5％ 和7．6％，金丝桃素作用后，S期百分比随着金丝桃素浓度增高而逐渐 减少。在0．5卜M和lpM金丝桃素组未出现凋亡细胞峰，而在2．5卜M 和 5 p M金丝桃素组 DNA直方图上，在 GI峰左侧出现亚二倍体细胞群 的凋亡细胞峰形。凋亡细胞定量结果显示：在2．spM和SVM金丝桃 素组凋亡细胞的比例分别为2．3％和6．1％。 （2）未经 PMA处理的人 RPE的。－PKC和 m－PKC的原始活性分别为 (35．34土4．l