细菌低温蛋白酶及其在海参活性物质提取中的初步研究

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海参是海洋中食用和药用的重要资源,海参中富含着大量的蛋白质、氨基酸、糖类、维生素族和矿物质元素等。传统的加工及烹饪海参的方法不利于人体对海参营养物质的吸收,造成了营养资源的浪费,本文的目的是探索并建立合适的深加工方法以提高其消化吸收率从而使海参的营养物质更好的被人体吸收。本课题利用从南极菌株中分离得到的具有水解功效的碱性蛋白酶和具有水解功效的中性蛋白酶(商品酶)以及水处理组分别处理海参,同时以海参多糖和海参多肽的粗得率为依据优化出两种酶的最佳工艺参数。由试验结果可知,南极微生物产生的碱性蛋白酶和中性蛋白酶(商品酶)处理的试验组拥有较高的海参多糖和多肽粗得率。同时本文还初步探索了所提取活性物质的抗氧化和抗肿瘤功效。本文的主要研究结果如下:先从南极土壤中筛选获得一系列菌株,使用考马斯亮蓝G-250法初步筛选出产蛋白酶活性较高的菌株,再应用Flion-酚法筛选出活性最高菌株I64。以菌体浓度和发酵液酶活为依据,对发酵产酶条件进行了初步优化,得到最适pH为7.0,最适培养温度为10℃,标准2216E培养基是较为理想的培养基;碱性蛋白酶最适作用pH为9.0,最适作用温度为30℃。采用中性蛋白酶(商品酶)、取自南极微生物的碱性蛋白酶和水处理组别处理海参,以考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白的含量和水解度,以硫酸苯酚法测定多糖的含量,以海参粗多糖和海参多肽粗得率为评价标准对这三种处理方法的最佳水解条件进行优化。得到中性蛋白酶处理组的最佳处理的条件为:水与海参的质量比为6:1,酶加载量1.5%,酶作用温度40℃,作用pH7.0,酶解时间6h;南极微生物中提取获得的低温蛋白水解酶最佳酶解条件为:水与海参的质量比为6:1,酶加载量1.5%,酶作用温度30℃,作用pH9.0,酶解时间3h;水处理组最佳条件为:45℃的条件下水解3和9h;碱性蛋白酶酶解后得到的活性物质的量较中性蛋白酶高出约3%~50%,较水处理组高出约85%~95%,为三种处理方式中最佳的酶制剂。以试验中得到的海参酶解液和粗多糖等物质应用于人神经母细胞瘤细胞和人胰腺癌细胞,对其抗氧化性和抗肿瘤性能进行了初步的研究。通过细胞试验验证了海参酶解液以及粗多糖对H2O2处理的人神经母细胞瘤细胞具有保护作用。利用酶标仪与抗氧化试剂盒对海参酶解液及海参多糖进行抗氧化活性测定。结果表明3个处理组所得多糖及酶解液均表现出一定的抗氧化能力,并且具有一定的浓度依赖性;3处理组多糖及酶解液清除羟自由基能力均明显高于其清除超氧阴离子自由基能力;同一浓度下多糖与酶解液清除羟基阴离子和超阳阴离子能力大小均为低温水解酶处理组>中性蛋白酶处理组>水处理组。其中低温水解酶处理组多糖在2.5mg/mL作用浓度下对羟基自由基清除率范围达50.6%~68.2%。采用MTT法检测所提取海参多糖、海参多肽和酶解液对体外培养的人胰腺癌细胞株(PANC-1)增殖活性的影响。结果表海参多糖和酶解液均可显著抑制PANC-1的增殖活性,而多肽对肿瘤细胞增殖活性无显著影响。
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