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黄萎病是棉花生长过程中最具毁灭性的真菌病害之一，日前仍没有药剂可以有效防治。培育抗病品种才是防治的关键，因此深入研究棉花抗病分子机制，对提高棉花抗性和产量具有重大意义。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，S/TK)是蛋白磷酸化过程中一类重要的激酶，通过磷酸化作用参与细胞间信号传导，在调控发育和抗病/抗逆方面具有重要作用。课题组前期鉴定出一个棉花丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（GbSTK），该基因受黄萎病菌和多种信号分子诱导，转GbSTK基因的拟南芥显著提高了植株黄萎病抗性。本研究继续从不同抗、感棉花品种中GbSTK基因的表达、GbSTK基因在调控抗性和发育中的功能以及其可能的互作蛋白方面深入研究，为揭示STK基因参与抗病机制提供依据。
LBD(lateral organ boundaries domain)基因家族是植物特异性转录因子，它包含保守的LOB(lateral organ boundaries)结构域，在植物生长发育以及代谢过程中起着至关重要的作用。目前，LBD基因在棉花中的功能尚未报道。本研究对陆地棉LBD基因进行全基因组鉴定及分析.结合陆地棉抗黄萎病转录组数据及启动子序列分析，筛选出受黄萎病菌诱导表达上调的GhLBD1OO基因，并对此基凶进行克隆及功能研究。
主要研究结果如下:
1.通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析GbSTK基因在不同抗病品种中的表达模式，发现GbSTK基因在感病邯208表达量最低，在抗病品种的表达量均高于感病品种，其中抗痫品种农人棉8号表达量最高，表明STK基因的转录水平与棉花抗黄萎病反应呈正相关关系。利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术有效沉默GbSTK基因，沉默GbSTK基因显著降低了植株抗病性，表明GbSTK基凶正向调控棉花黄萎病抗性。
2.构建酵母双杂交pGBKT7-GbSTK载体，无毒性且没有自激活活性，与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交，筛选出30个与GbSTK互作的蛋白。筛选出的SAMS互作蛋蛋白已有报道参与植物抗病反应。
3.转GbSTK基因的拟南芥丌花时莲座叶片数平均为7.5个，显著低于空载体对照植株（11.9个），转基因植株的开花时间较对照平均提早5-7d。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现，转基凶小同株系中FT和SOC1基因的表达水平显著高于对照植株，而LFY基因的表达受影响较小，表明STK基因可以影响开花关键基凶FT和SOC1的表达水平，进而调控转摹凶植株提早开花。
4.对陆地棉LBD基因进行全基因组分析，鉴定出128个LBD基因，所有LBD基因家族成员都含有保守的IOB结构域，分布在13个染色体上，系统进化树分析将陆地棉LBD基因分成两人类:ClassⅠ和ClassⅡ，分成8个亚组分别为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅰf、Ⅱa和Ⅱb。结合黄萎病菌胁迫下陆地棉农人601抗黄萎病转录组数据，发现属于ClassⅡa分支的4个成员受黄萎病菌诱导后在根中表达上调;启动子序列分析发现GhLBD100基因富含水杨酸(SA)、莱莉酸(JA)、赤霉素(GA)等与抗逆性相关的调控元件。
5.对陆地棉农大601进行黄萎病菌胁迫处理，qRT-PCR检测发现GhLBD100基因受黄萎病菌诱导表达上调;组织特异性表达分析结果显示该基因在根茎叶中，表达具有差异，在根中表达量最高，茎中次之，叶中表达量最低;棉苗叶面喷施SA、GA、ET、MeJA激素，结果显示，GhLBD100基因响应SA、GA、ET、MeJA信号。利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)沉默GhLBD100基因，棉株对黄萎病菌的抗性降低。测定沉默植株的H2O2、POD和CAT的含量，结果显示H2O2含量在0、6、12、24、36、48h都极显著高于对照植株，沉默植株中POD的含量在Oh与对照相比并无明显变化，在6h开始比对照植株含量明显升高，并且在6、12h沉默植株POD含量极显著高于对照组，在24h沉默植株相比对照组POD含量下降且在36、48h显著下降;在0、12、24、36h沉默植株的CAT含量低于对照组，植株体内CAT活力被抑制，试验结果表明GhLBD100基因参与调节植株体内的ROS平衡。
6.成功构建了GhLBD100的酵母双杂交载体，并通过酵母双杂交系统在黄萎病菌诱导的酵母双杂交cDNA文库中筛选出70个与GhLBD100互作的蛋白，其中包括SPL蛋白，据研究发现，SPL转录因子参与植物胁迫和植物激素反应等不利的环境变化。
本研究明确了棉花GbSTK基因在陆地棉不同抗感品种的表达差异，揭示了GbSTK基因具有同时提高植株黄萎病抗性和提早开花的生物学功能。全基因组鉴定出128个陆地棉LBD基因成员，启动子序列分析发现GhLBD100基因是潜在的黄萎病抗病基凶。GhLBD100基因通过调控CAT的活性影响H2O2的含量，调控POD的合成，参与调节植株体内ROS平衡，提高棉株对黄萎病的抗性。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase，S/TK)是蛋白磷酸化过程中一类重要的激酶，通过磷酸化作用参与细胞间信号传导，在调控发育和抗病/抗逆方面具有重要作用。课题组前期鉴定出一个棉花丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（GbSTK），该基因受黄萎病菌和多种信号分子诱导，转GbSTK基因的拟南芥显著提高了植株黄萎病抗性。本研究继续从不同抗、感棉花品种中GbSTK基因的表达、GbSTK基因在调控抗性和发育中的功能以及其可能的互作蛋白方面深入研究，为揭示STK基因参与抗病机制提供依据。
LBD(lateral organ boundaries domain)基因家族是植物特异性转录因子，它包含保守的LOB(lateral organ boundaries)结构域，在植物生长发育以及代谢过程中起着至关重要的作用。目前，LBD基因在棉花中的功能尚未报道。本研究对陆地棉LBD基因进行全基因组鉴定及分析.结合陆地棉抗黄萎病转录组数据及启动子序列分析，筛选出受黄萎病菌诱导表达上调的GhLBD1OO基因，并对此基凶进行克隆及功能研究。
主要研究结果如下:
1.通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析GbSTK基因在不同抗病品种中的表达模式，发现GbSTK基因在感病邯208表达量最低，在抗病品种的表达量均高于感病品种，其中抗痫品种农人棉8号表达量最高，表明STK基因的转录水平与棉花抗黄萎病反应呈正相关关系。利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术有效沉默GbSTK基因，沉默GbSTK基因显著降低了植株抗病性，表明GbSTK基凶正向调控棉花黄萎病抗性。
2.构建酵母双杂交pGBKT7-GbSTK载体，无毒性且没有自激活活性，与黄萎病诱导的海岛棉Pima90-53酵母双杂交cDNA文库进行杂交，筛选出30个与GbSTK互作的蛋白。筛选出的SAMS互作蛋蛋白已有报道参与植物抗病反应。
3.转GbSTK基因的拟南芥丌花时莲座叶片数平均为7.5个，显著低于空载体对照植株（11.9个），转基因植株的开花时间较对照平均提早5-7d。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现，转基凶小同株系中FT和SOC1基因的表达水平显著高于对照植株，而LFY基因的表达受影响较小，表明STK基因可以影响开花关键基凶FT和SOC1的表达水平，进而调控转摹凶植株提早开花。
4.对陆地棉LBD基因进行全基因组分析，鉴定出128个LBD基因，所有LBD基因家族成员都含有保守的IOB结构域，分布在13个染色体上，系统进化树分析将陆地棉LBD基因分成两人类:ClassⅠ和ClassⅡ，分成8个亚组分别为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅰf、Ⅱa和Ⅱb。结合黄萎病菌胁迫下陆地棉农人601抗黄萎病转录组数据，发现属于ClassⅡa分支的4个成员受黄萎病菌诱导后在根中表达上调;启动子序列分析发现GhLBD100基因富含水杨酸(SA)、莱莉酸(JA)、赤霉素(GA)等与抗逆性相关的调控元件。
5.对陆地棉农大601进行黄萎病菌胁迫处理，qRT-PCR检测发现GhLBD100基因受黄萎病菌诱导表达上调;组织特异性表达分析结果显示该基因在根茎叶中，表达具有差异，在根中表达量最高，茎中次之，叶中表达量最低;棉苗叶面喷施SA、GA、ET、MeJA激素，结果显示，GhLBD100基因响应SA、GA、ET、MeJA信号。利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)沉默GhLBD100基因，棉株对黄萎病菌的抗性降低。测定沉默植株的H2O2、POD和CAT的含量，结果显示H2O2含量在0、6、12、24、36、48h都极显著高于对照植株，沉默植株中POD的含量在Oh与对照相比并无明显变化，在6h开始比对照植株含量明显升高，并且在6、12h沉默植株POD含量极显著高于对照组，在24h沉默植株相比对照组POD含量下降且在36、48h显著下降;在0、12、24、36h沉默植株的CAT含量低于对照组，植株体内CAT活力被抑制，试验结果表明GhLBD100基因参与调节植株体内的ROS平衡。
6.成功构建了GhLBD100的酵母双杂交载体，并通过酵母双杂交系统在黄萎病菌诱导的酵母双杂交cDNA文库中筛选出70个与GhLBD100互作的蛋白，其中包括SPL蛋白，据研究发现，SPL转录因子参与植物胁迫和植物激素反应等不利的环境变化。
本研究明确了棉花GbSTK基因在陆地棉不同抗感品种的表达差异，揭示了GbSTK基因具有同时提高植株黄萎病抗性和提早开花的生物学功能。全基因组鉴定出128个陆地棉LBD基因成员，启动子序列分析发现GhLBD100基因是潜在的黄萎病抗病基凶。GhLBD100基因通过调控CAT的活性影响H2O2的含量，调控POD的合成，参与调节植株体内ROS平衡，提高棉株对黄萎病的抗性。