研究背景和目的淋巴瘤(lymphoma)是最常见的血液系统恶性肿瘤之一,其中90%为非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma, NHL)。近年来,我国淋巴瘤的发病率和死亡率呈上升趋势,目前治疗以化疗为主,辅以局部放疗及造血干细胞移植治疗。NHL的一线化疗方案为CHOP或RCHOP方案,虽然CHOP方案5年无病生存率可达40%-80%,但仍有15%—20%的患者对一线化疗方案治疗无效,出现难治、复发、耐药等现象,且传统化疗药物选择性不高,不良反应明显。因此,我们亟需寻求一种新的更有效的治疗药物。近年来,随着对分子信号通路调控肿瘤细胞增殖等生物学行为了解的不断深入,分子靶向治疗药物已凭其特异性、针对性和有效性较强,患者耐受性较好,而毒副反应相对于细胞毒药物较低等特点,在肿瘤治疗中取得很大成功,越来越多的抗肿瘤小分子化合物类药物被用于临床,逐步成为国内外肿瘤治疗领域的研究热点。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)是细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,MAPK信号通路的异常与肿瘤的发生和发展密切相关。细胞外信号调节激酶(extracelluar signal regulated kinase, ERK)信号通路是MAPK超家族中最早鉴定出来的亚通路。大量证据表明,T、B细胞淋巴瘤中MEK/ERK致癌信号通路处于活化状态。活化的ERK1/2能磷酸化大量底物,促进细胞增殖、增加细胞活力。AZD6244(Selumetinib;司美替尼；ARRY-142886),是一种小分子化合物类抗肿瘤药物,是促分裂原蛋白激酶(MEK1/2)ATP非竞争性抑制剂,在纳摩尔浓度的级别即可抑制MEK激酶活性,并可在许多肿瘤细胞系表现出良好的抑制作用。此外,AZD6244在人类癌症异种移植大鼠模型中显示出较高的药效活性。单一激酶靶点的抗肿瘤小分子化合物类药物是抗肿瘤小分子化合物类药物临床应用最早、最成功的例子。临床试验表明,某些类型肿瘤患者对MEK抑制剂单一用药起反应。然而,AZD6244在淋巴瘤细胞中能否起作用,其机制如何,我们仍不得而知。因此,本研究旨在探讨MEK选择性抑制剂AZD6244对人淋巴瘤细胞系Raji、MOLT4细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及其作用机制,为后续进一步研究提供实验基础和理论支持。实验方法一、观察AZD6244对淋巴瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响选取人Burrkit淋巴瘤细胞株Raji和人淋巴细胞白血病细胞株MOLT4为靶细胞(以下将Raji和MOLT4细胞统称为淋巴瘤细胞株)。将不同浓度(1、5、10、50uM) AZD6244处理淋巴瘤细胞株48h,Western blot检测各组细胞磷酸化ERK (pERK)的蛋白表达水平。CCK-8法检测AZD6244对两株细胞的增殖抑制作用。AnnexinV/PI双标法检测药物作用两株细胞凋亡率、PI单染检测细胞周期分布变化。二、研究AZD6244对淋巴瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期影响的机制1、AZD6244通过转录因子AP-1下调miR-92a的表达1.1基因芯片分析Raji细胞中被AZD6244调节的miRNAs10uM AZD6244处理Raji细胞48h,提取细胞中miRNAs,标本送上海康成生物有限公司进行基因芯片检测。采用芯片扫描仪(Genepix4000B)读取芯片图像的原始信号强度,随后用GenePix Pro6.0(Axon)软件处理数据。1.2定量PCR (qRT-PCR)验证AZD6244影响miR-92a的表达水平不同浓度药物(1-50uM AZD6244)作用淋巴瘤细胞株48h,收集细胞,Tizol法提取细胞中总RNA,通过紫外分光光度计测OD值检验RNA浓度、琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。根据基因芯片检测结果,从差异表达的miRNAs分子中选出miR-92a进行验证。按照第一链逆转录试剂盒说明书操作,逆转录合成cDNA,利用特异性引物采用两步法PCR扩增miR-92a基因,ABI7900HT检测各处理组中miR-92a的表达情况。1.3Promoter.2预测分析miR-92a上游序列根据Promoter2.0Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)在线预测miR-92a的上游序列。1.4沉默c-Jun基因,qPCR检测细胞中miR-92a表达水平采用脂质体转染法,以RNAiMAX转染c-Jun siRNA入Raji、MOLT4细胞24h,然后用lOuM AZD6244处理细胞48h。到相应时间点后收集细胞,提取各组细胞总RNA、合成cDNA。qRT-PCR技术检测细胞内c-Jun基因mRNA相对水平以检验基因沉默效率,并检测各组细胞内miR-92a相对表达水平。1.5qRT-PCR检测淋巴瘤细胞中c-FOS基因水平lOuM AZD6244处理Raji、MOLT4细胞48h,相应时间点后收集细胞,提取细胞中总RNA、合成cDNA。利用qRT-PCR技术检测细胞内c-FOS mRNA相对水平变化。2再导入miR-92a逆转AZD6244诱导的Raji和MOLT4细胞生长停滞采用脂质体转染法,以RNAiMAX将miR-92a mimics瞬时转染入淋巴瘤细胞作用24h,用10μM AZD6244处理48h,分别收集细胞。CCK-8检测细胞活力,qRT-PCR评估miR-92a的过表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布变化。3miR-92a通过靶定Bim基因3’UTR直接抑制其表达3.1生物信息预测法分析miR-92a的mRNA靶标运用在线生物信息预测计算法(www.microRNA.org)来分析miR-92a的直接mRNA靶标。3.2双荧光素酶报告实验,验证Bim为miR-92a的直接靶标首先通过PubMed查到Bim的3’UTR的序列,根据miR-92a结合位点所在区域序列,设计合成特异性引物。通过PCR扩增包含假定miR-92a结合位点的Bim基因的3’UTR序列,克隆至报告载体pSI-CHECK2质粒中。测序成功后扩增提取质粒,得到野生型3’UTR-Bim (wt3’UTR-Bim)质粒。根据美国Stratagene公司Quik-Change Site-Directed Mutagenesis试剂盒说明书操作,得到突变型3’UTR-Bim (mut3’UTR-Bim)质粒。接着,根据脂质体转染法,利用lipofectamine2000分别将3’UTR突变型载体、3’UTR野生型载体连同miR-92a mimics及其阴性对照共转染到293T细胞中。使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光强度。按下列公式计算荧光素酶活性：荧光素酶活性=海肾荧光素酶荧光值F/萤火虫荧光素酶荧光值R。以不含Bim互补序列载体的荧光素酶活性作为内参,测定转染后细胞的相对荧光素酶活性。3.3qRT-PCR、Western blot法分别检测转染入miR-92a mimics/AMO后Bim基因在mRNA和蛋白水平的变化采用脂质体转染法,以RNAiMAX分别将miR-92a mimics、mimics NC、 miR-92a AMO、AMO-NC转染入淋巴瘤细胞株中作用24h,10μM AZD6244处理48h后分别收集细胞。提取各组中细胞总RNA,根据Bim基因特异性引物进行PCR扩增并检测Bim mRNA水平变化。提取各组中细胞总蛋白,Western blot法检测Raji、MOLT4细胞中Bim蛋白表达。4沉默Bim基因逆转AZD6244调节的淋巴瘤细胞凋亡和生长周期阻滞4.1Western blot法检测AZD6244处理Raji、MOLT4细胞对Bim的表达影响将不同浓度(1-50uM) AZD6244作用淋巴瘤细胞48h后,收集细胞,提取总蛋白,免疫印迹法检测Bim蛋白表达。4.2沉默基因Bim, CCK8测细胞增殖力,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期变化利用RNAi技术,将RNAiMAX连同Bim siRNA一同转染入淋巴瘤细胞中,Western印迹法检测转染效率。CCK-8法分别检测基因沉默后Raji、MOLT4细胞增殖活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率以及细胞周期分布变化。统计学方法实验数据采用均数±标准差表示,所有数据根据软件SPSS13.0进行分析,显著性标准为P<0.05,即认为差异有统计学意义。两组间差异比较采用单样本t检验(One-Sample T-Test),多处理组的组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。实验结果1、 AZD6244抑制淋巴瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G1期1-50nM的AZD6244显著阻断两株细胞ERK磷酸化作用,且在低浓度时即可阻断。AZD6244以剂量依赖的方式显著抑制Raji和MOLT4细胞增殖,Raji、MOLT4细胞IC50分别为13.29uM和16.45uM。与增殖抑制作用一致,与对照组相比,AZD6244以剂量依赖方式增加细胞凋亡率及G1期细胞数。1-50uMAZD6244作用于Raji细胞的凋亡率分别为(9.10±0.61)%、(30.10±0.98)%、(57.10±1.25)%、(69.9±1.32)%；同样浓度梯度药物作用于MOLT4细胞凋亡率分别为(5.13±1.15)%、(36.70±1.49)%、(54.70±1.21)%、(71.80±1.55)%,差异有统计学意义(n=3,p<0.05)。2、 AZD6244通过转录因子AP1下调miR-92a的表达我们通过miRNA基因芯片技术筛选出Raji细胞中被AZD6244调节的miRNAs——MiR-92a,一个高度下调的miRNAs。随着AZD6244作用浓度的逐渐增加,淋巴瘤细胞中miR-92a mRNA表达水平逐渐降低,差异有统计学意义。Promoter2.0预测分析miR-92a上游序列发现一个潜在的转录启动子及一个定位于pri-miR-92a上游1.8kb处的转录因子AP1结合位点。随后验证实验中,qPCR检测沉默c-Jun基因后两株细胞中miR-92a表达水平显著低于对照组;另外10uM药物处理细胞后,处理组c-FOS mRNA水平也显著低于对照组,差异有统计学意义(n=3,p<0.05)。3、再导入miR-92a逆转AZD6244诱导的Raji和MOLT4细胞生长停滞与阴性对照相比,miR-92a mimics转染入Raji、MOLT4细胞后,细胞增殖力显著增加,分别为61.83±4.50%和58.90±5.35%；细胞凋亡率显著降低,分别由40.31±0.35%降至24.91±2.33%)、由43.25±1.04%降至26.40±1.57%；G1期细胞百分比显著减少,分别由74.66±2.62%降至60.13±1.37%、由77.75±1.47%降至63.19±0.86%,差异有统计学意义(n=3,p<0.05)。4、miR-92a通过靶定Bim的3’UTR直接抑制其表达生物信息预测法分析niR-92a的mRNA靶标为Bim基因。双荧光素酶报告实验验证结果示：与阴性对照组相比,miR-92a模拟物组引起的野生型Bim-3’UTR荧光衰减了将近2倍(p<0.01),然而突变型Bim-3’UTR未显示出对miR-92a的应答。RT-PCR、Western blot法分别检测转染入miR-92amimics/AMO后Bim基因在mRNA和蛋白水平的变化显示,与阴性对照相比,转染miR-92a模拟物后,细胞内Bim在mRNA和蛋白水平显著降低,但是转染入miR-92a内源活性抑制物后,细胞内Bim在mRNA和蛋白水平显著增高,差异均有统计学意义(n=3,p<0.05)。5、沉默Bim基因逆转AZD6244调节的淋巴瘤细胞凋亡和生长周期阻滞作用1-50uM AZD6244处理两株细胞后,细胞中Bim蛋白水平以剂量依赖方式增加。沉默Bim基因显著增加淋巴瘤细胞活力,Raji、MOLT4细胞增殖率分别为63.27±6.10%和62.73±4.01%;细胞凋亡明显减少,与对照组相比,凋亡率分别由44.2±1.76%降至29.35±1.47%、由51.40±2.31%降至32.8±1.56%；G1期细胞比例明显减少,差异有统计学意义(n=3,p<0.05)。实验结论1、AZD6244通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期于Gl期来抑制淋巴瘤Raji和MOLT4细胞增殖；2、AZD6244通过转录因子AP1下调miR-92a的表达；3、再导入miR-92a逆转AZD6244诱导的Raji和MOLT4细胞生长停滞；4. miR-92a通过靶定Bim3’UTR直接抑制其表达；5、沉默Bim基因逆转AZD6244调节的淋巴瘤细胞凋亡和生长周期阻滞作用；6、AZD6244通过MEK/ERK/AP1/miR-92a/Bim信号通路调节淋巴瘤细胞的增殖、凋亡及细胞周期分布；