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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是属于巴氏杆菌科放线杆菌属的革兰氏阴性球杆菌,能引起猪的传染性胸膜肺炎。该病的临床特征主要表现为肺坏死、出血和胸膜肺炎,具有高度接触传染性和致死性。目前,除了少部分尚未定型的菌株外,APP主要包括15种血清型,预防和控制本病依然主要使用灭活疫苗,由于型之间的交叉保护力不好,导致灭活苗的保护效果十分有限。本试验主要是对胸膜肺炎放线杆菌的omlA、plpA、lolB、omp2、ompAe及plpB六个外膜蛋白进行了克隆及原核表达,并研究了它们的免疫原性。从湖南送检的疑似胸膜肺炎的猪病料中分离到一株APP,并对其做了PCR鉴定、生化试验、药敏试验及动物感染试验,确定该株APP为血清1型。根据GenBank中发表的胸膜肺炎放线杆菌的全基因序列(Accession:CP001091),利用DNAstar软件挑选出6个外膜蛋白基因设计引物,其中ompAe基因引物中设有BamH Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点,其它五个蛋白基因均含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两个酶切位点。以APP全菌为模板对各目的基因进行PCR扩增,经双酶切处理后回收产物,将其连接到已经酶切处理好的pET-28a(+)表达载体中,并将连接产物转入到大肠杆菌DH5a中。经阳性鉴定和质粒的酶切鉴定,再将阳性质粒转入BL21(DE3)进行诱导。SDS-PAGE检测显示六个蛋白均能高效表达,其中omlA、 plpA及lolB为可溶性表达,omp2、ompAe及plpB为包涵体表达。Western Blot检测表明,omlA、omp2及plpA具有较好的免疫反应性用纯化的各蛋白分别对25g左右的昆明雌鼠进行免疫,均使用弗氏佐剂,初次免疫后的14天和28天加强免疫,每次剂量为50μg/只。以7LD50对各组小鼠进行攻毒,攻毒结果如下：plpA、lolB、ompAe、plpB、自家灭活苗及对照组均死亡,omlA及omp2组各存活一只,保护率为17%(1/6)。根据以上的攻毒结果,选择在omlA及omp2两个蛋白序列前均插入LTB序列,免疫组分别设为omlA+omp2、LTB-omp2、LTB-omlA,对照组仍然注射生理盐水,免疫剂量及方法均同上。各组的攻毒剂量均为5LD50,攻毒保护效果为：omlA+omp2组的保护率为33%(2/6),LTB-omp2组为33%(2/6),LTB-omlA组为17%(1/6)。结果显示,omlA及omp2这两个蛋白联合作用后免疫保护效果有所提高,插入LTB序列后,omp2比omlA的保护效果要好。