DHA对人肝癌细胞凋亡和侵袭力的影响及其机制研究

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【目的】(1)检测不同浓度二十二碳六烯酸(DHA)对人肝癌细胞株Bel-7402细胞增殖的影响。(2)研究不同浓度DHA对Bel-7402细胞凋亡的影响并进一步探讨其诱导凋亡的可能作用机制。(3)分析不同浓度DHA对肝癌细胞侵袭力的影响,并检测其作用肝癌细胞48h后基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的变化,为肝癌的转移和复发提供新的理论基础。【方法】(1)通过甲基噻唑基四唑比色法(MTT)、台酚蓝拒染实验检测不同浓度DHA对Bel-7402细胞增殖的影响。(2)运用流式细胞仪检测(FCM)检测早期细胞凋亡的情况,并通过实时聚合酶链反应(Real-time PCR)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法检测不同浓度DHA作用细胞后Bim基因、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax表达的影响;再用半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)凋亡检测试剂盒检测caspase-3表达相对值的变化。(3)通过细胞划痕及侵袭小室(Transwell)方法检测DHA对Bel-7402肝癌细胞迁移能力和侵袭力的影响;再运用细胞免疫组化染色方法检测MMP-9表达的影响。【结果】(1)与对照组(0μmol/L DHA)比较,不同浓度DHA对Bel-7402肝癌细胞的增殖均有明显抑制作用,且呈时间—剂量依赖性(P<0.05)。(2)在作用Bel-7402细胞48h后,不同浓度DHA(25,50,100,200μmol/L)处理组细胞出现早期凋亡率分别为10.28±2.28%,19.49±2.21%,25.20±5.53%和35.01±6.01%,与对照组(0.02±0.01%)相比,各组差异有统计学意义(P<0.05)。同时检测线粒体凋亡通路中与细胞凋亡密切相关的各蛋白表达变化,与对照组比较,各个DHA处理组促凋亡基因Bim基因mRNA表达显著升高,并与DHA浓度呈正比,其相对表达量有统计学差异(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低,而促凋亡蛋白Bax的表达显著升高;凋亡蛋白caspase-3的相对活性显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性(。3)在Transwell侵袭实验中,DHA(50、100、200μmol/L)处理组透膜细胞数与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);在细胞划痕实验中,动态观察0、12、24h,对照组细胞划痕间距明显缩短,24h后划痕基本愈合,DHA(50、100、200μmol/L)处理组随着DHA浓度的增大,细胞划痕间距缩短的趋势越小,各时段与对照组间比较差异显著。其中,DHA(25μmol/L)处理组与对照组相比,差异无统计学意义。不同浓度DHA作用48h后,细胞免疫组化结果显示,细胞MMP-9的表达随DHA浓度的增加而逐渐减少,其影响呈剂量相关性。【结论】(1)DHA可抑制人肝癌细胞Bel-7402的增殖并诱导细胞早期凋亡,且呈时间—剂量依赖性。(2)通过检测线粒体凋亡通路上多种蛋白表达变化,推测DHA诱导细胞凋亡的机制可能与激活线粒体凋亡通路有关。(3)DHA能在一定程度上抑制肝癌细胞的侵袭并降低其迁移能力,并呈剂量依赖性,其作用机制可能与抑制MMP-9蛋白的表达相关。
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