苍术,为菊科植物苍术Atractylodeslancea（Thunb.）DC.的干燥根茎,是临床常用的大宗药材,其主要药效成分是倍半萜结构的苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮及聚乙炔结构的苍术素,均具有挥发性。苍术具有燥湿运脾、散湿除痹、辟秽解郁、健胃补虚、养肝明目的临床功效,近年经济价值不断上涨。自然条件生于林下遮阴的野生苍术移栽至大田全光照环境,药材品质下降,光是不可忽略的重要环境因素之一。以往研究结果表明遮阴促进苍术主要药效成分积累,而这种促进机制尚不清楚。植物在响应遮阴时形成复杂的调控网络,研究表明吸收红蓝光的光受体（光敏色素、隐色素）感知遮阴的发生,然后触发级联反应。同时红光、蓝光是植物光合有效吸收的主要光源。因此,本研究选择了红蓝光质作为主要光源处理。为解析光质对苍术药用部位倍半萜和苍术素累积影响,了解次生代谢产物途径上合成部位极为关键。首先,开展苍术不同组织部位倍半萜和苍术素的累积分规律分析和其生物合成途径上相关基因的表达研究,分析合成与累积部位的一致性,以求有效地针对关键合成部位开展光质调控苍术药效成分合成的分析研究。其次,建立不同光质调控的苍术不同组织部位转录组数据平台,利用化学表型结合生物信息学方法进行数据分析,旨在挖掘受光质调控的苍术萜类和多炔类生物合成途径的关键酶基因及相关转录因子。最后,根据转录组数据筛选结果和文献报道,选择HY5基因做深入研究。HY5是光信号转导的中枢转录因子,研究表明HY5能够调控植物次生代谢的功能。因此,以苍术AlHY5转录因子作为光质调控主要药效成分累积研究的切入点,开展AlHY5的生物学特性及功能研究,并对主要药效成分合成途径中合成酶启动子预测区上AlHY5结合位点进行预测。本研究旨在解析光质影响苍术成分含量变化的原因,为光质对苍术倍半萜、苍术素生物合成的调控机制研究奠定基础,最终为生态种植中的遮阴研究提供参考。1研究内容（1）苍术药效成分在不同组织部位中累积与合成规律研究以野生茅苍术为研究材料,利用GC-MS方法检测根茎、根、花、苞片、叶片、茎6个组织部位的挥发性成分,根据峰面积做相对定量。通过不同组织部位GC-MS色谱图比较和聚类热图方法,分析挥发性成分及药效成分的累积规律;利用建立的野生苍术不同组织部位转录组平台数据对药效成分合成途径上的合成酶进行FPKM分析,分析药效成分合成酶的表达规律,进而分析产物合成部位。结合二者分析结果,分析合成与累积部位的一致性。利用苍术自发荧光特性研究根、根茎间可能存在的运输关系。（2）光质调控苍术不同组组织部位的转录组分析研究本章设置了 6组不同红蓝光比例对茅苍术幼苗材料进行处理,借助GC-MS仪器及RNA测序技术,获取不同处理中苍术药效成分含量表型并建立相应的转录组文库。结合不同组间的表型差异,对转录组数据进行PCA、差异基因筛选、KEGG通路和GO功能富集、基因趋势聚类、WGCNA、GSEA等多种方法的分析,筛选并整理参与光质调控药效成分途径中相关酶基因与转录因子。（3）AlHY5-生物学特性及功能研究系统发育聚类、多序列比对、基因组注释3种方式确定并获取AlHY5基因的CDS序列;利用生物信息学方法对AlHY5编码的蛋白结构进行理化、空间特性分析;利用克隆载体对AlHY5的CDS进行克隆;烟草亚细胞定位、拟南芥hy5突变体表型回补实验对AlHY5的核定位与光信号转导功能进行研究;plantcare网站预测萜类骨架合成酶上游2000bp启动子区的AlHY5结合位点。2研究结果（1）药效成分在苍术的不同组织存在特异性累积,根、根茎、叶均有合成药效成分的潜力通过GC-MS手段对野生苍术不同组织部位挥发性成分检测结果表明,根、根茎、茎、叶、花、苞片6个组织部位存在明显的药效成分特异性积累差异。苍术根茎和根是积累挥发性成分的主要部位,均积累药效成分苍术素;而仅根茎特异性高积累主要药效成分苍术酮,茎、叶、花、苞片少量或不积累药效成分。基因组注释结合KEGG绘制了更为清晰的苍术倍半萜骨架生物合成通路图,初步筛选出上游73条基因及1条调控苍术素生物合成的ACC基因,筛选出的基因将为苍术倍半萜生物合成研究奠定基础。调控倍半萜前体物质合成的合成酶主要在根、花两个部位表达,而非根茎。结合化学与转录结果,苍术倍半萜前体物质的合成与倍半萜积累部位不一致。利用激光共聚焦显微手段发现苍术物质有自发荧光特性,初步鉴定自发荧光物质含有苍术酮、苍术素,利用这一特性发现苍术植株体内存在药效成分的运输过程,尤其是根到根茎,目前在苍术研究中未见报道。综上,推测根、花、叶是产生倍半萜合成前体物质或倍半萜、苍术素的主要部位,通过苍术自身的运输机制,将成分运输到根茎贮存,在根茎中对药效成分前体物质进一步加工,最终促使根茎中药效成分的更高积累。因此,光照调控药效成分累积的机制研究重点不能仅局限于根茎,根、叶片、花中的药效成分合成均会受到光的调控,而影响根茎中药效成分的积累。（2）通过转录组数据分析筛选出参与光质调控过程的大量相关基因GC-MS结果显示光质引起苍术中苍术酮、苍术素含量差异的量变而非质变;红光的参与有利于药效成分的积累,苍术酮、苍术素含量随着红光比例的增加而呈现增加的趋势。白光组与红蓝3:1组存在显著组间差异,利用苍术酮、苍术素在光质处理中白光＞红光＞蓝光＞红蓝3:1的积累趋势作为基因筛选依据,在基因趋势变化分析中筛选具有相同趋势的聚类分支。光受体基因与萜类骨架合成酶的基因趋势聚类分析中,结果表明在叶片中蓝光受体与萜类骨架部分基因聚为一支,在根茎中萜类骨架部分基因与红光受体和蓝光受体聚为一支,根部萜类骨架合成酶基因和红蓝光受体未聚在一起。叶片、根茎更容易响应光质的变化。通过基因趋势聚类、WGCNA、GSEA等分析方法,叶片中筛选到51条酶基因,35条转录因子。其中酶基因中光合作用有1条,PSAF;昼夜节律5条,包括3条GI,1条HD3A,1条ADO3;脂肪酸合成通路3条基因,包括2条MOD1,1条S-ACP-DES6;萜类骨架基因19条,包括HMG1（2条）、HMGR2（2条）、DXS2、ISPH、FLCY、ICMEL2、Dehydrodolichyl diphosphate synthase 6、IPI2、At2g17570、Probablephytol kinase 3、Os07g0190000、dfrA、Os07g0190000、FTA、NUS1、At5g47720;倍半萜和三萜合成通路 4 条,包括beta-amyrin synthase、Baccharis oxidesynthase、PNA、dfrA;其它通路 20 条,包括Ank3、RPL10、MSL2、BZR1、RPS11、Loxhd1、CSLC6、SHSP-1、CWINVl（2 条）、CSE、HSP23.6、HSP25.3、ARF16、D14、FLA2、AMPD、FAF2、SKIP27、PIP2-7。叶中转录因子基因包括 SHMT、HSP70（3 条）、Pkinase、PK、Beta elimlyase、Methyltransf11、20G-FelIOxy、AAkinase、CCT（2条）、ADK、zf-AN1、Aldoseepim、ChaC、CDF3、SAP12、NLP1、EF2、ERD2B、ERD2A、CMT3、THA1、CRF5、AVT1、PIF3、HY5（2条）、APRR1、CHS2（2条）、COP1。根茎中筛选到23条酶基因,27条转录因子。其中酶基因中脂肪酸合成15条,包括 KAS1、LACS2、At3g45770、ARPC2A、S-ACP-DES6、fabZ、BCCP2、Picea abies、CAC3、S-ACP-DES6、KAS2、FATA、CAC3、ACC1、LACS4;萜类骨架合成2条,包括ICMEL2、HMGR2;倍半萜和三萜合成通路1条,包括PNA;其它5条,包括OS9、NAP1、CYCT1-3、NXT3、NPF4.3。其中根茎中的转录因子基因包括ATHB-12、BBP、SPA3、TOP2、COL5、MYB12、PIP5K7、MJ0531、AHK2、TTN、RDM3、TRRAP、CLPB1、SR45A、PRPF8、PMA1、ATX1、PHYB、HSPD、HSP70、HIPP26、TUBA、APRR5、ATHB-7、CYP72A129。（3）AlHY5基因具有核定位和光信号转导功能从生物信息学分析结果表明2条AlHY5序列同源性高,三维结构上均为同源二聚体。理化性质、三维结构结果表明二者在蛋白性质、空间结构上具有相似性。此外,与DNA结合的bZIP结构域蛋白序列一致。烟草亚细胞定位结果表明2条AlHY5转录因子均定位于细胞核内,从而证明苍术AlHY5基因具有核定位功能,与报道物种HY5结果一致。拟南芥hy5突变体表型回补结果证明苍术AlHY5可以在拟南芥体内发挥光信号转导的功能,借此证明苍术AlHY5有功能活性。烟草亚细胞定位及拟南芥hy5表型回补证明了苍术AlHY5具有传递光信号功能的转录因子,与相关研究结果一致。利用plantcare网站筛选出了含有HY5的G-box结合位点的萜类骨架合成关键酶基因HMGS、HMGR、DXS、DXR,为后续深入开展AlHY5转录因子与倍半萜生物合成酶基因的体内外结合验证实验提供研究基础。3研究结论（1）根、根茎、茎、叶、花、苞片6个组织部位存在明显的成分特异性差异。根茎、根贮存了丰富的挥发性产物,其中以萜类为主。根部以积累Modephene、α-Isocomene、β-Isocomene、β-Caryophyllene 等不含氧倍半萜为主,根茎以积累苍术醇、β-桉叶醇、苍术酮等含氧倍半萜为主。各部位均具有合成倍半萜的潜力,根是合成倍半萜成分的主要部位,推测根茎中氧化倍半萜成分的积累可能与根有密切的关系。（2）相比蓝光,红光有利于苍术酮、苍术素积累。红光信号PHYB、HY5的表达与苍术酮、苍术素的累积具有相同的变化趋势,其具有潜在的调控研究价值。（3）苍术体内克隆的AlHY5-1、AlHY5-2两条序列为结构相似的同型二聚体结构,其功能结构域保守,定位于细胞核内,在植物体内能够发挥光信号转导功能,为后续苍术体内体外功能验证奠定基础。