甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤,通常起源于滤泡旁或滤泡状甲状腺细胞。在过去几十年中,全球甲状腺癌的发病率仍在不断增加。甲状腺癌的发生、发展受到遗传、环境等多种因素的影响,随着高通量测序方法的出现,非编码RNA在甲状腺癌中的作用被发现。lncRNA作为非编码RNA,缺乏蛋白质编码能力,通过修饰和调节基因的表达发挥作用。我们通过分析已有数据库,得出差异表达的lncRNA,筛选甲状腺癌的最佳诊断生物标志物。其中LBX2-AS1差异性表达显著。既往研究发现,LBX2-AS1在甲状腺癌中高表达,并可促进甲状腺癌细胞的增殖和转移。而我们在前期预实验中发现,LBX2-AS1可以增加甲状腺癌细胞的糖酵解并促进细胞周期,类似研究均未见报道,可能是LBX2-AS1促进甲状腺癌进展的新机制。本研究通过生物信息学技术对甲状腺癌组织和癌旁正常组织的基因表达数据进行整合分析,选取LBX2-AS1为研究对象,深入探讨其作用机制,并根据其作用机制选取合适的应对措施,以期获得与甲状腺癌相关的生物标志物,为甲状腺癌的诊断、预防和治疗等提供研究基础。本研究共分为以下四部分内容。第一部分基于生物信息学分析筛选甲状腺癌的生物标志物目的:通过生物信息学技术筛选甲状腺癌差异表达的基因,寻找具有诊断意义的生物标志物。方法:1.从TCGA数据库中下载甲状腺癌患者的基因表达数据和生物信息,分析在癌组织和癌旁组织中差异表达的基因。2.应用机器学习筛选最佳的生物标志物。3.利用R语言建立RF模型、DT模型和SVM模型,评估三种分类预测模型的诊断能力。4.构建lncRNA-miRNA-mRNA互作网络。结果:1.共筛选出107个差异表达的lncRNAs,其中上调的lncRNAs 79个,下调的lncRNAs 28个;筛选出差异表达的miRNAs 81个,其中上调的miRNAs 49个,下调的miRNAs 32个;共筛选出差异表达的mRNAs 515个,其中上调的mRNAs 339个,下调的mRNAs 176个。2.筛选出11个差异表达的lncRNAs可作为最佳的生物标志物,其中下调的lncRNAs包括ADD3-AS1、MIR100HG、FAM95C、MORC2-AS1、LINC00506、ST7-AS1、LOC339059、MIR181A2HG、FAM181A-AS,上调的lncRNAs包括LBX2-AS1和BLACAT1。筛选出6个miRNA可作为最佳的生物标志物,其中下调的包括:hsa-mi R-9-5p、hsa-mi R-199b-5p、hsa-mi R-214-3p;上调的包括:hsa-mi R-146b-3p、hsa-mi R-4709-3p、hsa-mi R-34a-5p。3.对筛选的11个lncRNA,应用RF、DT、SVM分别构建预测模型,RF、DT和SVM模型中的AUC值分别为99.2%、92.2%和99.0%。4.构建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络,网络包含11个诊断lncRNA、6个诊断miRNA和95个差异表达的mRNA。小结:我们通过对TCGA数据库中甲状腺癌组织与癌旁组织中差异表达的lncRNAs和miRNAs进行分析,筛选出11个lncRNAs和6个miRNAs可作为具有诊断意义的生物标志物。第二部分lncRNA LBX2-AS1在甲状腺癌组织中的表达以及临床相关性研究目的:明确lncRNA LBX2-AS1在甲状腺癌组织中的表达以及与临床指标的相关性。方法:1.收集甲状腺癌患者的临床标本,采集患者信息。2.通过荧光定量PCR检测LBX2-AS1在甲状腺癌组织及其癌旁组织中的表达。应用免疫组化检测甲状腺癌组织及其癌旁组织中PKM2的表达。3.分析甲状腺癌组织中LBX2-AS1的表达水平与患者临床病理特征间的关系,分析甲状腺癌组织中LBX2-AS1的表达水平与PKM2的表达水平之间的相关性。结果:1.与癌旁组织相比,甲状腺癌组织LBX2-AS1的表达水平明显升高（P＜0.05）。2.LBX2-AS1的表达水平与性别、年龄和肿瘤大小无显著相关性（P﹥0.05）,与淋巴结转移和肿瘤分期相关（P＜0.05）。LBX2-AS1表达水平高的患者更容易出现淋巴结转移（χ~2=5.853,P＜0.05）,其肿瘤分期更高（χ~2=3.903,P＜0.05）。3.LBX2-AS1的表达水平与PKM2的表达水平正相关（R~2=0.479,P＜0.05）小结:LBX2-AS1在甲状腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织。LBX2-AS1表达水平与PKM2的表达水平正相关。第三部分lncRNA LBX2-AS1在甲状腺癌细胞中的作用机制探讨目的:阐明LBX2-AS1在甲状腺癌细胞中的作用。方法:1.培养甲状腺癌细胞系TPC-1,构建LBX2-AS1稳定低表达细胞系。2.应用MTS检测敲低LBX2-AS1表达对TPC-1细胞增殖能力的影响。3.应用Transwell法检测敲低LBX2-AS1表达对TPC-1细胞侵袭和转移能力的影响。4.应用流式细胞术检测敲低LBX2-AS1表达对TPC-1细胞周期的影响。5.应用海马实验检测敲低LBX2-AS1表达对TPC-1细胞糖酵解能力的影响。结果:1.与对照组相比,敲低LBX2-AS1可显著抑制TPC-1细胞的增殖能力（P＜0.05）。2.与对照组相比,敲低LBX2-AS1可显著抑制TPC-1细胞的侵袭和转移能力（P＜0.05）。3.与对照组相比,敲低LBX2-AS1可显著抑制TPC-1细胞的细胞周期,导致G1期细胞比例显著增加（P＜0.05）,S期细胞比例显著降低（P＜0.05）。4.与对照组相比,敲低LBX2-AS1可显著抑制TPC-1细胞的糖酵解能力（P＜0.05）。小结:在甲状腺癌细胞系中敲低LBX2-AS1表达可抑制细胞增殖、侵袭和迁移,减少细胞糖酵解,抑制细胞周期,使细胞周期停滞在G1期。第四部分lncRNA LBX2-AS1通过增强有氧糖酵解促进甲状腺癌进展的机制以及青蒿素抗癌机制探讨目的:阐明LBX2-AS1增强有氧糖酵解的机制,探索青蒿素通过抑制糖酵解治疗甲状腺癌的可能性。方法:1.应用实时荧光定量PCR和Western Blot检测LBX2-AS1下游靶基因的表达。2.通过双荧光素酶报告系统验证LBX2-AS1/miR-491-5p/PKM2之间的直接结合。3.应用海马实验阐明青蒿素对甲状腺癌细胞糖酵解的影响。结果:1.与对照组相比,TPC-1细胞LBX2-AS1敲低可导致cyclin D1、HIF-1α、PKM2在mRNA以及蛋白水平表达均显著降低（P＜0.05）。2.miR-491-5p模拟物分别抑制了含有LBX2-AS1和PKM2 mRNA的psiCHECK2的荧光素酶活性,在敲低LBX2-AS1的TPC-1细胞下调mi R-491-5p表达,可抑制LBX2-AS1敲低对cyclin D1、HIF-1α和PKM2降低的作用,表明LBX2-AS1通过作为分子海绵与mi R-491-5p结合来调节PKM2,进而调控cyclin D1和HIF-1α表达。3.青蒿素可以与HIF-1α自发结合,并通过促进HIF-1α蛋白降解降低甲状腺癌细胞的糖酵解水平。小结:LBX2-AS1通过miR-491-5p/PKM2通路促进甲状腺癌细胞有氧糖酵解。青蒿素可抑制甲状腺癌细胞糖酵解过程。结论:1.LBX2-AS1可作为甲状腺癌进展的生物标志物。2.LBX2-AS1通过miR-491-5p/PKM2通路促进甲状腺癌细胞的糖酵解。3.青蒿素能够通过直接靶向降解HIF-1α,从而抑制甲状腺癌细胞的糖酵解。