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木质纤维素因其丰富、可再生、不与人类需求竞争而受到广泛关注。纤维素是木质纤维素最重要的组成部分,其完全降解需要三种切割位点不同的酶协同作用,包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。随着对纤维素酶的广泛研究,这些生物催化剂被广泛应用于众多工业领域。考虑到对多种酶的协同作用的需求,在单个细胞中表达多种酶可能提高降解效率并减少生产工艺流程。单个细胞中表达多种基因的方法常常依赖于多种筛选方式并且操作复杂。目前,有很多关于纤维素酶两两融合的报道,然而没有关于多于两种纤维素酶融合的报道。因此,为了减少多功能纤维素酶表达过程中复杂的操作,我们首次使用融合策略构建具有三种不同纤维素酶功能的单基因。为了证明构建单基因多功能酶的可行性及潜在价值,将该基因在酿酒酵母中表达并筛选具有三种纤维素酶功能的菌株。在本研究中,我们设计引物来扩增三个纤维素酶基因的催化结构域,并在前两个基因反向引物末端添加柔性接头(G4S)3的反向编码序列以及限制性内切酶位点。使用相应的限制酶消化PCR产物,将其纯化后用T4 DNA连接酶进行连接。以酶连混合物为模板进行PCR得到的3.0 kb的DNA片段即为三功能纤维素酶单基因,命名为bce。我们将bce克隆到酿酒酵母表达载体pHBM368-pgk上,经过抗性筛选、酶切验证后得到重组载体pHBM368-pgk-bce。利用该载体转化酿酒酵母INVSc1,并进行了尿嘧啶营养缺陷型筛选以及显色底物平板筛选。经过总纤维素酶活性测定以及菌落PCR验证后,选出具有较高纤维素酶活性的重组菌株,命名为INVSc1-BCE。我们对单基因三功能纤维素酶BCE与单功能纤维素酶进行了特异性底物活性分析与比较。在45℃、pH 6.0的条件下,BCE的β-葡萄糖苷酶活性和内切葡聚糖酶活性分别达到2.24 U/mL和2.76 U/mL,分别比BG和EG高30.93%和12.34%。然而,BCE的外切葡聚糖酶活性比CBH低8.63%,达到0.28U/mL。结果表明,BCE具有三种不同的纤维素酶活性。另外,测定了BCE与单功能纤维素酶的总纤维素酶活性。在45℃、pH 6.0的条件下,BCE的滤纸酶活性达到272.5 U/L,高于BG和EG,与CBH相当。结果说明,单基因三功能纤维素酶具有降解复杂底物(滤纸)的能力。对比特异性底物活性的差异,可以推测在降解过程中单基因三功能纤维素酶表现出了协同作用。最后,测定了 BCE滤纸酶活性的最适反应条件为55℃、pH 6.5,此条件下活性达到443.0 U/L。综上所述,利用融合策略构建单基因三功能纤维素酶,符合三种纤维素酶协同作用的降解模式,操作简单、效果明显、具有可行性;并且对多种其他类型的酶降解木质纤维素的过程具有借鉴意义。