反螺旋酶（Reverse Gyrase, RG）首先发现于嗜热硫化叶菌，目前在所有超嗜热古菌中都发现有 RG存在。通过基因组序列分析，证实它是唯一一个超嗜热生物中的特异蛋白，所以很可能 RG在维持高温下基因组结构的稳定性方面发挥重要的作用。由于超嗜热古菌遗传体系的缺乏，目前对于 RG的研究限于其在体外的生理生化功能。本课题是以本实验室分离到的一株冰岛硫化叶菌 pyrEF基因自发突变株Sulfolobus islandicus E233S为原始出发菌株，以尿嘧啶合成酶基因pyrEF作为筛选标记，构建RG基因的敲除质粒，并转化S. islandicus E233S，利用同源重组的原理对RG基因进行敲除。　　本实验室在S. islandicus中建立一种全新的基因敲除策略来敲除RG基因，命名为“标记整合后目标基因环出”，这种方法在突变体构建的每一步都存在特异性筛选，第一步由于M-arm和L-arm的插入使其能在缺乏尿嘧啶的平板上生长出双交换转化子，在第二步的反筛选中，双交换转化子会被杀死而只有缺失突变株能够生长，利用FOA的选择L-arm再次发生单交换从而使目标基因被缺失的突变株。与其他方法不同的是，可以从转化子是否能够继续增殖或者其生长繁殖的能力来判断基因对于个体生长的必要性。这是第一个能够直接检测突变体生长状况的基因敲除策略。　　在65℃本文用这种新的基因敲除策略成功得到了RG基因缺失株，S. islandicus在缺少RG基因的情况下也能生长，RG基因对S. islandicus在65℃的生长不是必需的，但是可以看出 RG基因对高温下维持 DNA结构的稳定性有非常重要的作用，很可能通过引入正超螺旋或独立于酶活之外的因素对高温下染色体拓补结构有重要的影响。实验通过全新的基因敲除策略在65℃筛选得到了RG基因缺失突变株，并验证了反螺旋酶对高温下细胞生长的重要功能，为后续研究提供了良好的实验材料和实验基础。　　同时本文对转录起始元件进行了研究，微生物可以利用不同的糖作为碳源和能源，而这些糖代谢相关的基因一般都存在高度精细地表达调控。极端嗜热古菌 S. islandicus可以利用多种糖作为碳源，其中阿拉伯糖能够诱导多个基因包括阿拉伯糖代谢途径中多个酶的表达，因此研究这几个基因启动子中的Initiation Element（IE）序列对于揭示古菌转录起始基本模式及古菌转录起始调控机理具有重要意义。　　为了分析启动子内的 DNA顺式元件，本文采用了硫化叶菌报告基因系统，即以lacS基因作为报告基因，E. coli-Sulfolobus穿梭质粒作为载体，并以S. islandicus E233S pyrEF/lacS双突变菌株作为宿主。将带有或不带有IE序列的启动子分别克隆到报告质粒中 lacS基因的上游控制其表达，然后将报告质粒转化到 S. islandicus E233S菌株中，得到相应的转化子，并比较各个转化子的lacS比活性，从lacS酶活性的变化鉴定IE序列对于启动转录的影响。　　Sso1300、Sso3117、和 Sso3124的启动子活性在加入IE序列之后分别下降为原始活性的0.94倍、0.66倍和0.71倍，Sso3118却上升为8.3倍。对Sso3118的IE序列进行分析，发现其 A/T含量明显高于其他三个基因的 IE，反转录荧光定量 PCR显示S-3118IE的lacS mRNA水平是S-3118的6.2倍，可见IE序列很大程度上在转录水平上影响lacS的表达，证实了Sso3118启动子中IE是一个参与转录起始的重要元件。