上世纪20年代Otto Warburg发现大部分肿瘤细胞主要通过高速率的糖酵解获得能量,糖酵解产生的丙酮酸主要在细胞质中转化为乳酸(即使在含氧量充足的情况下),而在正常细胞中丙酮酸主要进入线粒体氧化呼吸链,这一现象被称作Warburg效应(有氧糖酵解)。肿瘤细胞依赖于这一特殊的代谢方式来满足快速增殖的物质和能量需求。丙酮酸激酶M2(PKM2)对于肿瘤细胞代谢类型的转化和维持具有非常重要的作用。与此同时,PKM2可以调节多个肿瘤相关转录因子的活性。因此抑制PKM2的表达有可能抑制肿瘤细胞所依赖的代谢途径和信号通路,从而抑制肿瘤细胞的生长和存活。过去几年有不同研究组尝试通过RNA干扰的方式沉默PKM2以期待抑制肿瘤细胞的生长,但是得到了互相矛盾的结果。我们认为全面了解沉默PKM2后细胞信号通路的改变,对于更好地应用沉默PKM2治疗肿瘤是必需的。在本论文中我们详细研究了沉默PKM2后细胞内信号通路的改变。首先,我们通过基于慢病毒载体的RNA干扰技术在H1299和A549细胞中沉默了PKM2的表达。通过蛋白稀释和Western blot实验,我们发现PKM2的沉默效率在95%以上。与野生型细胞相比,我们没有发现PKM2沉默细胞增殖速率的明显变化,但是PKM2沉默后细胞形态与野生型细胞有很大不同。接着我们检验了沉默PKM2是否影响其他糖酵解相关蛋白的表达。我们发现在PKM2稳定沉默细胞中己糖激酶Ⅰ(Hexokinase Ⅰ)和己糖激酶Ⅱ(HexokinaseII)的表达水平明显降低而丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydrogenase)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ(Cox Ⅳ)的表达水平升高。同时全细胞水平的蛋白质翻译后修饰,包括赖氨酸磷酸化修饰、丝氨酸／苏氨酸磷酸化修饰、赖氨酸乙酰化修饰以及氧联乙酰葡糖基修饰,在PKM2沉默细胞中都发生了显著的变化。为了进一步检验PKM2沉默细胞中可能发生改变的信号通路,我们分析了P13K-AKT信号通路的激活情况。我们发现在PKM2沉默细胞中,磷酸化AKT水平显著地升高,而总AKT蛋白水平没有发生改变。AKT的激活也引起了AKT下游蛋白TSC2和GSK3β的磷酸化。同时我们发现这一现象并不局限于H1299细胞,在多种肿瘤细胞中沉默PKM2都会引起AKT的激活。我们进一步探究了PKM2沉默细胞中磷酸化AKT水平升高的机理。人们之前就发现抑制糖酵解可以引起细胞内AKT的激活。在我们的实验体系中野生型细胞在葡萄糖饥饿条件下磷酸化AKT水平会升高,而PKM2沉默细胞中磷酸化AKT水平对葡萄糖饥饿不敏感。在PKM2沉默细胞中回复表达PKM2后将恢复PKM2沉默细胞中磷酸化AKT水平对葡萄糖饥饿的敏感性。我们也检验了糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖对AKT磷酸化的影响。和葡萄糖饥饿类似,2-脱氧葡萄糖处理可以引起对照细胞中AKT磷酸化的升高,但是对PKM2沉默细胞中AKT磷酸化水平没有显著影响。因此我们认为沉默PKM2后细胞内糖酵解受到抑制,进而激活AKT作为一种胁迫响应。我们接着检验了PKM2沉默细胞中AKT磷酸化对于不同代谢通路和信号通路抑制剂的敏感性。我们发现PKM2沉默细胞中磷酸化AKT对于P13K和AKT抑制剂都是敏感的。在PKM2沉默细胞中抑制PI3K-AKT信号通路可以显著地抑制细胞的增殖,并引发细胞凋亡。因此PKM2沉默细胞的生存依赖于PI3K-AKT信号通路的激活。