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课题来源:2009年度广东省医学科研基金课题,项目编号:A2009679研究背景和目的:目前,自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia,AIHA)/Evans综合征的确切病因和发病机制仍未完全阐明,复发率及病死率仍较高,给家庭和社会均造成较大的经济负担。即使经过治疗方法的改进,采用肾上腺皮质激素、免疫抑制剂甚至脾切除治疗AIHA/Evans综合征,但仍有反复发作者,此类病例疗效差,病程仅数月至数年不等,病死率高。这提示仍有其他免疫异常机制在该病的发病过程中起作用,且未被发现和缺乏相应的治疗措施。日益增多的证据显示包括T细胞亚群功能失衡和共刺激分子表达异常等细胞免疫异常机制在自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)中起重要作用。目前,已有大量证据论证了CD80和CD86共刺激因子控制体液免疫和细胞免疫的重要性。同时,也有大量的文献认为CD4+CD25+调节性T细胞在诱导和维持外周自身免疫耐受中至关重要的作用,在自身免疫性疾病的发生发展中起重要作用。有文献报道在调节性T细胞的生长和动态平衡中,CD80和CD86起了重要的作用;调节性T细胞从抗原提呈细胞中获得CD86后能提高它们的抑制作用。Mqadmi等应用CD25单克隆抗体处理C57/B16小鼠去除其体内的CD4+CD25+调节性T细胞,然后将异体红细胞注入C57/B16小鼠的腹腔,制成小鼠的AIHA模型,发现缺失CD25的C57/B16小鼠AIHA的发生率从30%升至90%,将从小鼠脾脏纯化的CD4+CD25+调节性T细胞注入小鼠体内,可以阻止自身抗体的产生,减轻溶血的发作,而注入CD4+CD25-调节性T细胞,没有此作用,从而在动物模型中证明了CD4+D25+调节性T细胞在AIHA的发病机制中起着重要作用。而随后我们的前期研究也发现AIHA发作患者CD4+CD25+调节性T细胞比例明显减少,之后我们研究外周血淋巴细胞共刺激分子CD80、CD86在AIHA/Evans综合征患者中存在异常。而共同研究共刺激分子CD80、CD86和CD4+CD25+调节性T细胞与AIHA或Evans综合征的文献却较少见。如果我们继续深入研究AIHA/Evans综合征的免疫异常机制,将很可能揭示新的免疫异常机制并因而发现新的治疗措施,提高治疗水平,从而降低复发率和病死率,造福患者和社会,具有较大的社会和经济意义。研究方法:1.选取汕头大学医学院附属粤北人民医院2010年4月~2013年2月期间诊治的初发AIHA或Evans综合征患者24例次为发作组,其中男6人共7例次,女12人17例次,AIHA18例次,均为温抗体型AIHA患者,Evans综合征6例次,中位年龄49岁(18~74岁);11例次同期诊治的AIHA/Evans综合征治疗后部分缓解或完全缓解者为缓解组,其中男性2人共3例次,女性8人8例次,中位年龄44岁(18~72岁);27人27例次均为同期体检健康者为正常对照组,均无肿瘤或自身免疫性疾病病史,其中男10例次,女17例次,中位年龄51岁(19~72岁)。2.对各组标本进行外周血活细胞免疫荧光标记,使用FACS-Calibur流式细胞仪检测人PBLsCD80、CD86和CD4+CD25+调节性T细胞。检测结果分别以PBLsCD80、CD86占PBLs的百分率和PBLsCD4+CD25+调节性T细胞占PBLs的百分率表示。3.统计方法:以SPSS16.0统计软件进行统计处理,以p<0.05为差异有统计学意义,p<0.01为差异有显著统计学意义。4.根据本研究所得出的统计结果,结合国内外文献探讨AIHA/Evans综合征的发病机制。结果:1.AIHA/Evans综合征发作组、缓解组和正常对照组PBLsCD80表达水平变化无统计学意义,分别为(6.59±7.67)%VS(4.20±5.89)%(P>0.05),(4.51±2.83)%VS (4.20±5.89)%(P>0.05).2. AIHA/Evans综合征发作组PBLs共刺激因子CD86表达水平较正常对照组升高(5.90±4.82)%VS(2.69±1.35)%(P<0.05),而缓解组与正常对照组PBLsCD86表达水平变化无统计学意义(5.54±5.88)%VS (2.69±1.35)%(P>0.05)。3. AIHA/Evans综合征发作组PBLsCD4+T细胞表达水平较正常对照组明显下降(25.63±12.01)%VS(36.44±7.76)%(P<0.01),而缓解组与正常对照组PBLsCD4+T细胞表达水平变化无统计学意义(29.08±12.29)%VS(36.44±7.76)%(P>0.05)。4. AIHA/Evans综合征发作组PBLsCD4+CD25+调节性T细胞表达水平较正常对照组及治疗后缓解组明显下降,(2.91±2.28)%VS(5.86±2.28)%(P<0.01),(2.89±2.30)%VS (5.37±3.91)%(P<0.01).5. AIHA/Evans综合征发作组PBLs的CD80、CD86表达水平分别与CD4+CD25+调节性T细胞表达水平均无明显相关性(P均>0.05)。6.PBLs的CD80、CD86、CD4+和CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平分别与性别、年龄、血红蛋白浓度、网织红细胞百分比、总胆红素、间接胆红素均无明显相关性(P均>0.05)。结论:1.本研究通过流式细胞术检测AIHA/Evans综合征发作组、治疗后缓解组及正常对照组发现:AIHA/Evans综合征发作组PBLs的CD86表达水平较正常对照组明显升高,而PBLs的CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞表达水平较正常对照组却明显降低;正常对照组与缓解组PBLs的CD86、CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞表达水平变化无统计学意义,且治疗后缓解组较发作组CD4+CD25+调节性T细胞表达水平明显上升。本研究结果提示AIHA/Evans综合征发病时PBLs的CD86、CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞表达水平同时存在异常,可能参与了AIHA/Evans综合征发病时的免疫异常机制。2. AIHA/Evans综合征发病时PBLs的CD80、CD86表达水平分别与CD4+CD25+调节性T细胞表达水平均无明显相关性。3.PBLsCD80、CD86、CD4+和CD4+CD25+调节性T细胞表达水平与性别、年龄、血红蛋白浓度、网织红细胞百分比、总胆红素、间接胆红素的均无相关性,提示上述指标表达水平不能反映AIHA/Evans综合征的严重程度,可能还有其他免疫异常机制参与了AIHA/Evans综合征的溶血发作。