帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种常见的老年性中枢神经系统退行性疾病。迄今为止,人们对PD的发病机制仍未明确。其中,PD与细胞凋亡及泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)功能障碍的关系成为近年来研究PD发病机制的热点。Ndfip1蛋白因与Nedd4蛋白特异结合而命名,目前研究已显示Ndfip1蛋白对神经细胞的保护作用非常突出。本课题采用目前使用较为广泛的MPP+(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型及小鼠胚胎中脑多巴胺能神经元原代细胞损伤模型作为研究对象,通过转入Ndfip1的慢病毒表达载体并开启或关闭Ndfip1的表达,研究Ndfip1对MPP+诱导的PD体外实验细胞模型的神经保护作用与其参与调节泛素化过程的关系。第一部分,Ndfip1慢病毒载体及相关质粒的扩增、提取和鉴定。首先将含有Ndfip1的质粒pFU5×UAS mm Ndfipl C-Flag SV40Puro(载体编号8599)进行酶切鉴定Ndfipl cDNA的序列,然后我们将该载体和其他与病毒包装相关的质粒分别转化大肠杆菌感受态细菌,挑取单克隆,摇菌,提质粒,琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得质量和浓度相对较高的目的载体。第二部分,包装病毒颗粒及建立四种细胞模型。采用293T细胞包装病毒颗粒,并将病毒感染SH-SY5Y细胞,使用抗生素潮霉素和嘌呤霉素筛选细胞。通过Western Blot检测,确认获得了许多能稳定表达Ndfip1的阳性克隆。加入4HT诱导我们得到了Ndfip1过表达的细胞株。将pGIPZ shRNA for Ndfip1瞬时转染上述稳定细胞株,在加入4HT情况下,检测Ndfip1蛋白的表达变化,最终确认了该shRNA达到了抑制(knock down) Ndfip1表达的作用。显性负表达(4HT诱导,显性负载体pFU mm Ndfip1Y42A67A EGFP SV40puro W (Ubiquitin Promoter)细胞模型的获得也采用瞬时转染。至此成功构建四种不同的细胞模型：Ndfip1内源性表达(WT型)、过表达(4HT诱导)、显性负表达(显性负载体)及抑制表达(pGIPZ shRNA for Ndfip1瞬时转染)。第三部分,Ndfip1对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤及凋亡具有保护作用。首先以上述四种细胞模型为基础,采用MPP+(1-甲基-4-苯-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导细胞使其成为PD细胞模型,以此作为研究对象,进行Ndfip1对细胞损伤和凋亡的保护作用研究。采用去除生长因子诱导细胞凋亡,通过MTT实验和流式细胞术,获得的结果表明Ndfip1的表达可以保护SH-SY5Y细胞,减少细胞凋亡,而Ndfip1显性负和抑制性表达则显示对保护细胞的能力明显下降,表明抑制和减少Ndfip1的表达不能起到保护神经细胞的作用。随后,再通过抗泛素抗体检测泛素化过程,结果显示Ndfip1保护细胞的作用伴随多种蛋白质泛素化的增加,表明Ndfip1发挥作用的分子机制涉及多种蛋白质的泛素化过程。在研究Ndfip1在抑制神经细胞凋亡过程中与Hect家族蛋白的相互作用时,主要通过免疫沉淀、Western Blot检测了Nedd4-1及Itch两种Hect家族蛋白,结果显示Ndfip1保护细胞的作用可能是通过与Nedd4-1相结合而引起的,因为Nedd4-1是泛素E3连接酶,因此Ndfip1可能募集多种蛋白与Nedd4结合,进而引起这些蛋白泛素化,从而对细胞凋亡等进行调节,这与上述Ndfip1引起泛素化增加的结果是一致的,也表明Ndfip1可能通过桥梁作用引起多种蛋白泛素化,对多种细胞过程发挥重要作用。实验中也检测了另一种Hect家族蛋白Itch。结果显示,随着4HT加入时间的延伸,Ndfip1的表达逐渐增加直到维持一个较高的表达水平,与此同时Itch的表达却逐渐下降,表明Ndfip1保护神经细胞的作用可能与Itch蛋白的表达降低有关。本课题组也研究了Ndfip1与磷酸化Erk (p-Erk)之间的关系,结果显示,Ndfip1的作用伴随p-Erk水平的降低,表明Ndfip1的神经细胞保护作用的分子机制与Erk相关的信号转导通路有关。第四部分,Ndfip1对MPP+诱导的小鼠胚胎中脑神经元原代细胞PD模型具有保护作用。制备小鼠胚胎中脑神经元原代细胞,用MPP+诱导其凋亡,通过转染Ndfip1质粒研究Ndfip1蛋白对神经元凋亡是否有保护作用。实验结果证明MPP+能诱导其发生凋亡,而过表达Ndfip1蛋白的实验组相比于对照组,小鼠胚胎中脑神经细胞凋亡数目明显减少,表明过表达Ndfip1对小鼠胚胎中脑神经元原代细胞的凋亡起抑制作用,能有效的减少细胞凋亡的数目,对神经细胞有一定的保护作用,为进一步研究Ndfip1对PD的保护作用奠定了实验基础。综上所述,Ndfip1蛋白可以显著抑制去除生长因子等方法诱导的SH-SY5Y的细胞凋亡,具有神经保护作用；且这种作用伴随多种蛋白的泛素化增加以及与Hect家族蛋白Nedd4等的结合；同时还会随着时间的延伸引起Itch蛋白的表达下降以及Erk磷酸化水平的下降。这些结果表明Ndfip1蛋白具有明显的神经细胞保护,且其作用过程与某些蛋白的泛素化密切相关,其作用靶点与Itch蛋白及Erk信号通路有关。通过小鼠胚胎中脑神经元原代细胞PD模型,再次表明过表达的Ndfip1对小鼠胚胎中脑神经原代细胞的凋亡起抑制作用,能有效的减少细胞凋亡的数目,对神经细胞有一定的保护作用。通过MPP+诱导的两种不同的PD细胞模型,首次探讨Ndfip1对PD细胞模型中神经细胞保护作用的分子机制,阐述Ndfip1蛋白对神经细胞作用的生物学意义,为进一步寻找Ndfip1蛋白的作用靶点和相关的信号转导通路提供了依据；本项目的开展将有助于制定有效的策略用于对神经系统退行性疾病的临床治疗。